ветом 1.1

Какие будут отзывы о препарате Ветом 1.1

Слышал только хорошее - сам хочу купить. Это вещь!

Мне тоже надо!

П.С. А он от чего? 😊

hollowpoint
Мне тоже надо!

П.С. А он от чего? 😊

Это не фуфло, а препарат бактерий Bacillus Subtilis. Сделан в Новосибирском Академгородке.
В поиск.

Русич
Это не фуфло, а препарат бактерий Bacillus Subtilis. Сделан в Новосибирском Академгородке.
В поиск.

Русич
Это вещь!

"Ветом 1.1" - иммуностимулятор на основе природной бактерии Bacillus subtilis.

Вырабатывает в желудочно-кишечном тракте альфа2-интерферон.

Применялся 15 лет в военных госпиталях до 1993г. Это изобретение военно-промышленного комплекса (микробиологический центр Кольцово).

Препарат от мыслимых и немыслимых болезней (чума, холера, гепатит, туберкулёз, любые формы гриппа, атипичная пневмония, сибирская язва, укус энцефалитного клеща, рота- и паравирусного энтерита, ринотрахеита, бактериальных инфекций (сальмонеллез, дизентирия, синдром хронической усталости и др.) и т.д.).

При любых болезнях "Ветом 1.1" поднимает у человека иммунную защитную систему, поднимает иммунитет. Это пробиотик. Бактерии, которые крайне необходимы человеку.

"Ветом 1.1" практически не имеет противопоказаний (за исключением язвенной болезни желудка в период обострения и аллергии на сенную палочку). Передозировка не страшна. Отсутствуют возрастные ограничения. Длительный срок хранения даже после вскрытия упаковки.

Когда Вы отправляетесь в поход, на дачу (особенно на несколько дней) возьмите с собой 1-2 пачки "Ветом 1.1". С его помощью Вы сможете защитить себя и своих спутников при возникновении пищевых отравлений или при укусах клещей, когда медицинская помощь недоступна. В этих случаях "Ветом 1.1" следует принимать «ударными» дозами по 1 чайной ложке через каждый час.

Стоимость 1 пакетика "Ветом 1.1" (50 гр.) - 150 рублей (для жителей России)

http://www.mednatur.ru/index.php?stat_id=13

***********

Лечит всё!
Офигеть!

Интересно мнение использовавших препарат

На странице компании производителя (кстати, некоего ООО, к Академгородку отношение имеющий может быть только территориально) на одной из страниц имеется упоминание о награждении директора данного ООО Орденом «Во Славу Отечества».
А посему - лохотрон. Признание не покупают, а заслуживают...

Unforgiven
посему - лохотрон

Можно тогда ссылку на исследования, проведённые какими-либо мед. центрами или подобные? Только настоящими, а не их же Ветомовскими лжемедиками-распространителями? А то в Интернете сходу находится только об увеличении прироста молодняка цыплят-бройлеров, лечении хорьков и прочее... А также то, что почему-то у данного "лекарства" ветеринарный сертификат. Как сказали на каком-то форуме, (цитата) "... если фирма вам впаривает продукт для животных, значит и вас самих держит за свиней."

http://www.miac-nso.ru/content/view/571/44/

+ пиццот к Unforgiven
Ссылочку на medscape или e-medicine, пожалуйста.

"Ветом 1.1 применяют для профилактики и лечения желудочно - кишечных заболеваний диарейной симптоматики, бактериальных (колибактериоз, дизентерия, сальмонеллез, кокцидиоз) и вирусных (рота- и парвовирусный энтерит, грипп, парагрипп, ринотрахеит, гепатит, чума плотоядных и т.д.) заболеваний, а также для исправления иммунодефицитных состояний и улучшения функционирования желудочно - кишечного тракта животных: сельскохозяйственных (крупный и мелкий рогатый скот, свиньи, лошади), домашних (кошки, собаки и др.) и диких, в т.ч. птицы и пушных зверей. Для стимуляции роста и развития молодняка, получения дополнительных привесов. Препарат Ветом 1.1 выпускается в виде порошка, таблеток. "

Это отсюда : http://www.vetom.info/vetom1.htm

Это со страницы производителя. Мне, как русскоязычному россиянину из данного абзаца очевидно, что применяется для лечения животных, не так ли?
На сайте http://vettorg.net/pharmacy/105/707/ ветом отнесен к ветеринарным препаратам.
И вот эта страница (правда, почти годичной давности) http://www.pharmcontrol.ru/?p=1276

объясняет, что ветом - только для животных. А также жЫвотных, очевидно.

ВЕТом - от слова ветеренария?

!!! Категорически запрещено применять порошок и капсулы при любых видах онкологии !!!

А это почему интресно?

Чушь какая. Препарат давно и успешно применяется и для людей. Bacilus Subtilis - нормальная микрофлора здорового кишечника.

Похоже, он и на животных то не очень то и испытывался... http://zooforum.ru/index.php?s=6a13c882b1a68a2713b5d833ea359c7d&showtopic=27762&pid=155343&st=0&#entry155343

А вот тут говорят, что противопоказаний нет и для онкологии!
Хотя на другие говорят об ограничениях.

http://forum.hnet.ru/lofiversion/index.php/t48107.html

кстати!

"...но одна проблема его продают только в зоомагазинах..."

(там же)

А вот говорят, что консервы для кошек люди могут есть, а для собак - нет.
Это правда?

А вот здесь http://www.hlebodar.com/people3.html говорят, что эти бактерии

Русич
Bacillus Subtilis

Все таки, прав был Русич, послав в поиск.

история с этим ветомом, на самом деле, мутная. мутная она в том смысле, что препараты на основе Bacillus Subtilis действительно создавались как для людей так и для животных. создавали их военные, в частности, предприятие ВЕКТОР из новосибирска. оно же один из производителей советского биологического оружия.

я бы пить его не стал по трем причинам:

1) клиническая его безопасность никем не доказана т.к. это закрытые разработки, а особенность препаратов от военных - чтобы солдат выжил до выполнения задачи, а дальше не важно, что с ним будет.

2) то, что продается и рекламируется в инете это, скорее всего, фуфло, разводка. кто-то элементарно хочет навариться на эксплуатации ареала секретности.

3) применение иммуностимулирующих препаратов значительно снижает продолжительность жизни.

зы: я видел тезисы про "ветом" и аналоги, но сейчас нпостараюсь найти.

в поиск, кстати, бесполезно посылать. сходил, там лажу всякую пишут 😊

вот немного про "препараты" этого типа для тех кто понимает молекулярную биологию и иммунологию

RU (11) 2142287 (13) C1

(51) 6 A61K35/74, C12N1/20, C12N1/20, C12R1:07, C12R1:10, C12R1:125

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Статус: по данным на 26.07.2007 - действует

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 1999.12.10
(21) Регистрационный номер заявки: 97121774/13
(22) Дата подачи заявки: 1997.12.16
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1997.12.16
(45) Опубликовано: 1999.12.10
(56) Аналоги изобретения: RU 2035185 C, 20.05.95. SU 1398868 A, 30.05.88. RU 1722502 A, 30.03.92. RU 2067616 C, 10.10.96. RU 2084233 C, 20.07.97. EP 0287699 A, 26.10.88. WO 89/09607 A, 19.10.89.
(71) Имя заявителя: Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"; Товарищество с ограниченной ответственностью Научно- производственная фирма "Исследовательский центр"
(72) Имя изобретателя: Щелкунов С.Н.; Петренко В.А.; Рязанкина О.И.; Репин В.Е.; Андреева И.С.; Ильичев А.А.; Белявская В.А.; Сандахчиев Л.С.; Серпинский О.И.; Сиволобова Г.Ф.; Синяков А.Н.; Перминова Н.Г.; Тимофеев И.В.; Леляк А.И.; Ноздрин Г.А.; Катковский Л.П.; Данилюк Н.К.; Масычева В.И.
(73) Имя патентообладателя: Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"; Товарищество с ограниченной ответственностью Научно- производственная фирма "Исследовательский центр"
(98) Адрес для переписки: 633159, Новосибирская обл., Новосибирский р-н, п.Кольцово, ГНЦ ВБ "Вектор", Патентный отдел, Мистюрину Ю.Н.

(54) ШТАММЫ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS И BACILLUS LICHENIFORMIS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В КАЧЕСТВЕ КОМПОНЕНТОВ ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ВИРУСНЫХ И БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ, И ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ ЭТИХ ШТАММОВ

Изобретение предназначено для медицины и ветеринарии. Штаммы бактерий Bacillus Sabtilis ВКПМ В-7092, ВКПМ В-7048 и штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В-7038 используются в качестве компонентов препарата против вирусных и бактериальных инфекций. Препарат содержит смесь биомассы указанных штаммов в споровой форме с титром не менее 31010 спор/г. В состав препарата входят также крахмал и сахар при определенном количественном соотношении компонентов. Комплексный бактериальный препарат обладает более широким спектром антивирусной и антибактериальной активности. 4 с.п.ф-лы, 8 табл.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к биотехнологии, а именно генетической инженерии, и может быть использовано в медицине и ветеринарии для получения препаратов против вирусных и бактериальных инфекций.

Однако известный природный штамм не обладает противовирусной активностью. Кроме того штамм имеет недостаточную антагонистическую активность, что экспериментально подтверждено, например, в отношении таких тест-культур, как Pseudomonas vulgaris и Pseudomonas fluorescens. В этой связи препараты, изготовленные на основе данного штамма также будут обладать низкой антагонистической активностью и не иметь антивирусную активность.

Известен штамм бактерий Bacillus licheniformis N 31 (Институт микробиологии и вирусологии им. акад. Д.З. Заболотного АН Украины), используемый в качестве одного из компонентов препарата биоспорин [2], предназначенного для лечения гнойно-септических послеродовых заболеваний.

Однако указанный штамм не обладает противовирусной активностью.

Известен бактериальный препарат на основе штамма Bacillus subtilis C-3102 [4]. Препарат содержит указанную бактериальную культуру в сухой форме, а также пищевые добавки-наполнители для получения фармацевтических или ветеринарных препаратов. Технология получения препарата включает суспензионное культивирование штамма бактерий в питательной среде, содержащей источник углерода, источник азота, неорганические вещества, витамины, аминокислоты при pH 6-8 и температуре 35-40oC в течение от 0,5 до 7 дней. Бактериальную культуру отделяют от питательной среды, промывают и концентрируют. Полученный продукт высушивают и смешивают с добавками-наполнителями.

Недостатком данного препарата является то, что он не обладает противовирусной активностью. Кроме того препарат имеет сложную технологию получения, т. к. включает операции по отмывке бактериальных клеток от компонентов питательной среды, а затем концентрирование бактерий центрифугированием.

Наиболее близким аналогом предлагаемого препарата (прототипом) является бактериальный лечебно-профилактический препарат в жидкой форме, включающий биомассу бактерий Bac. subtilis 5/6, биомассу бактерий Bac. subtilis 2/10 и биомассу бактерий Bac, licheniformis 31. Смесь указанных компонентов препарата представляет собой микробную ассоциацию при объемном их соотношении 1:1: 1 (содержание каждого компонента препарата 100-150 млрд. микробных клеток в 1 мл физраствора). Указанную жидкую форму препарата используют для лечения гнойно-септических послеродовых заболеваний [5]. Препарат имеет широкий спектр антагонистической активности.

Недостатком данного препарата является то, что он имеет жидкую форму, которая долго не хранится и не удобна в применении, а также не обладает противовирусной активностью.

Задачей предлагаемых изобретений является получение бактериальных штаммов Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis и на их основе создание комплексного бактериального препарата, обладающего более широким спектром антивирусной и антибактериальной активности.

Для решения указанной задачи предлагается:

- штамм бактерий Bacillus subtilis IC-9, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ГНИИ Генетика под номером ВКПМ В-7048 от 31.05.95 г. Штамм получен из природного изолята селекционным путем. Штамм подвергался селекции на подавление бактериального и грибкового роста. С лучшими вариантами проводили эксперименты по подавлению роста: трихофитов, микроспориумов, эпидермофитонов, кандидомикозов и других грибков.

- штамм бактерий Bacillus licheniformis IC-1, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ГНИИ Генетика под номером ВКПМ И-7038 от 30.05.95 г. Штамм получен из природного изолята селекционным путем. Штамм подвергался селекции на подавление бактериального и грибкового роста. С лучшими вариантами проводили эксперименты по подавлению роста болезнетворных штаммов: стафилококка, стрептококка, сальмонелл, трихофитов, микроспориумов, эпидермофитонов, кандидомикозов и др.

- штамм бактерий Bacillus subtilis IC-16 (pBMB5), полученный путем трансформации штамма B. subtilis ВКПМ В-7048 (IC-9) рекомбинантной плазмидой ДНК pBMB 5, содержащий ген -2 интерферона. Полученный штамм IC-16 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ГНИИ Генетика под номером ВКПМ В-7092. Плазмида pBMB 5 способна реплицироваться в бациллах и содержит в своем составе ген -2- интерферона человека, промотор для экспрессии этого гена, сайт посадки рибосом (SD-сайт) и сигнальный пептид -амилазы B. amyloliquefaciens для секреции интерферона в культуральную среду, а также несущую устойчивость к канамицину.

Кроме того, указанная задача решается тем, что в препарате против вирусных и бактериальных инфекций, включающем смесь биомассы штаммов Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis в равных соотношениях, согласно изобретению, он дополнительно содержит крахмал и сахар, а в качестве биомассы штаммов бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis используют биомассу штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-7092, ВКПМ В-7048 и Bacillus licheniformis ВКПМ В-7038 в споровой форме с титром не менее 31010 спор/г при следующем количественном соотношении компонентов (мас. %):

Смесь спор бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis в равных соотношениях - 0,1 - 1,0

Крахмал - 1,0 - 3,0

Сахар - Остальное

Высокий титр спор бактерий (1010 спор/г и более) обеспечивается за счет создания одинаковых условий спорообразования для каждой бактериальной клетки.

Иммобилизация спор бактерий на крахмале обеспечивает им дополнительную механическую защиту, предотвращает слипание спор бактерий и обеспечивает более равномерное их распределение в массе наполнителя.

При применении препарата крахмал способствует ускорению прорастания спор бактерий, что повышает эффективность его действия.

Сахар является не только сорбентом-наполнителем, но и оказывает на препарат стабилизирующий и консервирующий эффект, создает более мягкие условия для хранения спор бактерий.

Кроме того, предлагаемый способ значительно упрощает технологию получения препарата как на этапах культивирования (в технологии отсутствует использование дорогих ферментов, не требуется очистка и концентрирование препарата), так и на этапах получения готовой его формы (удаление или перераспределение влаги совмещено с получением готовой формы препарата).

Культурально-морфологические и биохимические свойства штамма Bac. subtilis ВКПМ В-7048

Штамм ВКПМ В-7048 относится к аэробам, грамположительная бактерия. При росте на среде LA дает форму колоний, похожую на ромашку. Колонии белесые. Штамм имеет вид палочек. Величина клеток односуточный агаровой культуры (2-4)(0,5-0,8) мкм. Споры образуют. Капсулы не образуют. По Граму окрашиваются положительно. Штамм размножается при 15-50oC, оптимальный рост при температуре 36-37oC.

Хорошо образуют эндоспоры на картофельном агаре. Эндоспоры эллипсоидные, расположены центрально и не выходят из размеров спорангия. Околоспоральных включений не обнаружено.

Через 48 ч роста при +37oC на суслоагаре культура имеет непрозрачные матовые колонии с фестончатым краем. Хорошо снимается петлей с поверхности агара.

FH среды: минимальные 4; максимальные 8; оптимальные 6-7.

Штамм размножается при 37oC на средах МПВ и МПА.

Биохимические свойства. Вызывает гидролиз крахмала, редукцию нитратов. Расщепляет глюкозу, сахарозу, маннит мальтозу и лактозу.

Штамм не является фитопатогенным.

Штамм ВКПМ В-7048 продуцирует антибиотик широкого спектра действия, подавляющий рост грибков, стафилокков, стрептококков и синегнойной палочки.

Культура не растет в анаэробных условиях и при 10% NaCl, не образует газ из NO в анаэробных условиях.

При длительном хранении штамма субстанцию лиофильно высушивают. Для размножения бактерий используют мясопептонный агар (МПА), а культивирование проводят при температуре 37oC.

Культурально-морфологические и биохимические свойства штамма Bac. licheniformis ВКПМ В-7038

Штамм ВКПМ В-7038 относится к аэробам; грамположительная палочка, способная образовывать споры. Размеры вегетативных клеток (0,5-0,8) мкм и (1,5-3) мкм, иногда достигают до 5 мкм. Споры эллиптические, преимущественно расположены центрально, не более одной в клетке-спорангии, без отчетливой раздутости спорангии.

Вегетативные клетки B. licheniformis ВКПМ В-7038 хорошо растут на богатых питательных средах (мясопептонный бульон - МПБ и мясопептонный агар - МПА) при температуре (37-40)oC. Нет роста в присутствии 0,02% азида, но наблюдается рост на агаре Сабуро, при 7% NaCl и при добавлении 0,001% лизоцима.

Наблюдается слабый рост в анаэробном агаре.

На мясопептонном бульоне pH (7,30,1) через 48 часов инкубации при температуре (371)oC образует помутнение среды, а на поверхности - сухую пленку; на мясопептонном агаре Хоттингера pH (7,30,1) - слабовыпуклые сухие непрозрачные белесые колонии, полиморфные, мелкозернистые диаметром (4-6) мм, врастающие в питательную среду.

Для получения спор культуру, выращенную на твердой питательной среде, бактериологической петлей пересевают в пробирки или флаконы на картофельный или пшеничный агар, закрывают ватно-марлевыми тампонами и инкубируют при температуре 37oC в течение (7-10) суток под углом 45oC агаром вверх. После завершения споруляции культуру хранят при 4oC в холодильнике.

Биохимические свойства. Вегетативные клетки B. licheniformis ВКПМ В-7038 гидролизуют казеин и крахмал, каталазоположительны. Реакция Фогес-Проскауэра положительная.

Штамм не является патогенным для растений, животных и человека.

Штамм ВКПМ В-7038 продуцирует антибиотик широкого спектра действия, подавляющий рост грибков, стафилокков, стрептококков и синегнойной палочки.

При длительном хранении штамма субстацию лиофильно высушивают.

Технология получения рекомбинантного штамма B. subilis ВКПМ В-7092 (IC-16) и характеристика его свойств

Для передачи генетической информации используют метод трансформации протопластов B. subtilis, описанный Chang and Cohen [6]. Методика состоит в следующем. 50 мл среды LB (бульон Лурия) в колбе на 500 мл инокулируют 2,5 мл ночной культуры B. subtilis ВКПМ В-7048 (IC-9) и растят в условиях интенсивной аэрации до D600=0,4ое/мл. Затем клетки осаждают центрифугированием в роторе JA-20 при 6000 об/мин в течение 10 мин, удаляют надосадочную жидкость, а клетки ресуспендируют в 5 мл среды SMMP. Среду SMMP приготавливают, смешивая равные объемы 2хSMM и LBP. Состав 2хSMM-буфера: 0,5 М сахароза, 0,02 М малеат Na, 0,02 М MgCl2, pH 6,5. Среду автоклавируют при 0,7 атм. Состав среды LBP (на 1 л): 20 г триптона ("Difco"), 10 г NaCl, 10 г дрожжевого экстракта ("Difco"), 80 г поливинилпирролидона ("Fluka"). Среду автоклавируют при 0.7 атм.

К ресуспендированным клеткам добавляют 0,5 мл раствора, содержащего 20 мг/мл лизоцима (раствор лизоцима в SMMP готовят незадолго до использования и стерилизуют фильтрованием через фильтры "Millipore" с размером пор 0,2 нм).

Клетки инкубируют при 37oC при мягком перемешивании. Через определенные промежутки времени отбирают аликвоты и исследуют их в фазово-контрастном микроскопе, чтобы определить количество протопластов. Когда в протопласты превратятся не менее 99% клеток (1-1,5 часа), их осаждают в роторе JA-20 в течение 15 мин при 5000 об/мин, промывают 1 раз с помощью ресуспендирования в SMMP и вновь центрифугируют в тех же условиях.

Далее протопласты ресуспендируют в 1/15 объема стартовой культуры. т.е. в 3,3 мл SMMP, добавляют 5-10 мкг плазмидной ДНК и 1,5 мл 40%-ного раствора полиэтиленгликоля, растворяют 50 мл 2хSMM, доводят водой до 100 мл, автоклавируют при 0,7 атм, осторожно перемешивают и оставляют на 2 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 5 мл среды SMMP для разбавления полиэтиленгликоля, перемешивают и центрифугируют в роторе JA-20 при 5000 об/мин в течении 10 мин. Протопласты ресуспендируют в 1 мл среды SMMP и инкубируют при 37oC при мягком перемешивании в течение 1,5 часов. Аликвоты по 0,1 мл рассевают на чашки со средой ДМ3, содержащей 1 мг/мл канамицина, для регенерации протопластов. Состав среды ДМ3 (на 1 л): 200 мл 4% агара ("Difco"), 500 мл 1 М сукцината Na, pH 7,3, 100 мл 5%-ных казаминовых кислот (Difco), 50 мл 10% дрожжевого экстракта ("Difco"), 100 мл 3,5% K2HPO4 и 1,5% KH2PO4, 25 мл 20% глюкозы, 20 мл 1 М MgCl2. После автоклавирования при 0,7 атм в среду добавляют 5 мл 2%-ного BSA.

В качестве контроля трансформации протопластов B.subtilis используют описанную выше процедуру, но вместо плазмидной ДНК добавляют такой же объем буфера TE (10 мМ HCl), pH 8,0, 1 мМ ЭД-ТА) или воды. Для контроля интактности и жизнеспособности протопластов одну аликвоту высевают на среду, не содержащую канамицина).

В результате проделанных процедур на среде с канамицином получено 7 клонов (после трансформации B. subtilis плазмидной ДНК pBMB 5). Контрольные чашки, содержащие протопласты после добавления к ним буфера ТЕ были пусты. На чашке со средой без канамицина протопласты выросли сплошным газоном.

Протопласты, устойчивые к канамицину, рассевали штрихом на чашки Петри со средой LA (агаризованный бульон Лурия), содержащий 50 мкг/мл канамицина. Для контроля используют среду LA с 50 мкг/мл ампициллина, а также LA с 10 мкг/мл тетрациклина. Все 7 протопластов дали хороший рост на среде с канамицином, слабый рост на среде с ампициллином и отсутствие роста на среде с тетрациклином. Исходный штамм B. subtilis не дает роста на среде с канамицином или тетрациклином и имеет слабый рост на среде с ампициллином.

Для описания морфологии колоний полученных 7 протопластов суспензию этих культур в физиологическом растворе (0,85% NaCl), высевают на среду JA и растят при 37oC 18 часов. В качестве контроля используют исходный штамм B. subtilis IC-9 (ВКПМ-7048).

5 из 7 колоний протопластов имеют такую же морфологию, как исходный штамм B. subtilis IC-9. Диаметр колоний составляет 0,3- 0,5 мм. Колонии шероховатые, напоминают ромашку, т.е. углубление в середине, а затем плотный валик, окаймляющий "сердцевину", и более прозрачные края, слегка волнистые.

При окраске по Ожешко [7] и микроскопии мазков культур, выращенных на среде JA в течение ночи при 37oC и выдержанных в течение 3 часов в холодильнике, обнаружены продолговатые вегетативные палочки и овальные споры. Все 7 протопластов и исходном штамме B. subtilis имеют одинаковую картину.

Все протопласты обнаруживают стабильность поддержания плазмиды в клетках, т. е. при хранении на среде JA с 50 мкг/мг канамицина и последующих пересевах на аналогичную среду не наблюдалось утери признака устойчивости к канамицину.

Для выделения плазмиды из клонов после трансформации исходного штамма использовали методику Birnboim and Doly [8]. С помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле и последующей окраски бромистым этидием было показано наличие плазмиды в трансформированных клонах.

Штамм B. subtilis ВКПМ В-7092 характеризуется следующими свойствами.

Культурально - морфологические свойства. B. subtilis относится к аэробам. При росте на среде LA дает форму колоний, похожую на ромашку. Колонии белесые. Бактерии имеют вид палочек. Величина клеток односуточной агаровой культуры (2-4)(0,5-0,8) мкм. Споры образуют. Капсулы не образуют. По Граму окрашиваются положительно. Штамм размножается при 15-50oC, оптимальный рост при температуре 36-37oC.

Биохимические свойства. Вызывает гидролиз крахмала, редукцию нитратов. Расщепляет глюкозу, сахарозу, маннит, мальтозу и лактозу.

Штамм устойчив к канамицину и не является фитопатогенным.

Штамм ВКПМ В-7092 синтезирует 2- интерферон и антибиотик широкого спектра действия, подавляющий рост грибков, стафилококков, стрептококков и синегнойной палочки.

При длительном хранении штамма субстацию лиофильно высушивают. Для размножения бактерий используют мясопептонный агар (МПА), а культивирование проводят при температуре 37oC.

Пример 1. Исследование непатогенности B. subtilis ВКПМ-7048

Исследование проведено в лаборатории антибактериальных средств и микробиологической токсикологии Всероссийского научного центра по безопасности биологически активных веществ (ВНЦ БАВ).

Патогенность микроорганизма оценивали по выживаемости инфицированных животных, по их внешнему виду и общему поведению, высеваемости бактерий из крови и органов в различные сроки после заражения, а также по макроскопической картине внутренних органов при вскрытии животных в конце срока наблюдения.

В работе использованы лабораторные животные двух видов. Опыты поставлены на 12 нелинейных белых мышах (18-20 г) и 4 белых крысах (180-200 г).

Исследуемый штамм B. subtilis выращен на агаре Хоттингера при 32oC в течение суток. Заражающая доза для животных составляла 10 микробных тел на животное. Микробную взвесь вводили внутрибрюшинно в 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия. Животных наблюдали на протяжении 30 суток.

Высевы микроорганизмов из крови и органов проводили на агар Хоттингера в чашки Петри. У мышей микробиологической анализ крови, печени и селезенки производили трехкратно за период наблюдения - через 3, 7 и 14 суток после введения изучаемого штамма, у крыс - однократно через 14 суток. Во всех случаях брали по 2 животных каждого вида.

В конце срока наблюдения (30 суток) по 2 животных каждого вида забивали этиловым эфиром, вскрывали и производили макроскопическую оценку внутренних органов: сердца, легких, желудка, печени, почек и селезенки.

В результате проведенных исследований установлено нижеследующее. В течение опыта не зарегистрировано гибели животных. Не отмечено каких-либо изменений в их внешнем виде и поведении. При макроскопической оценке внутренних органов на 30 день наблюдения патологических изменений не обнаружено.

Микробиологический анализ не показал высеваемости микроорганизма из крови и внутренних органов животных во все сроки исследования.

На основании отсутствия гибели животных и каких-либо изменений в их внешнем виде и общем поведении на протяжении 30-ти дневного наблюдения, отрицательных результатов микробиологического анализа крови, печени и селезенки, нормальной картины внутренних органов животных при вскрытии в конце срока наблюдения сделан вывод, что штамм Bacillus subtilis IC-9 (ВКПМ В-7048) является непатогенным.

Пример 2. Исследование непатогенности штамма Bacillus licheniformis ВКПМ-7038

Исследуемый штамм B. licheniformis выращен на агаре Хоттингера при 35oC в течение суток.

Исследования проводились на белых мышах. Заражающая доза для животных составляла 1010 микробных тел на животное. Микробную взвесь вводили внутрибрюшинно в 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия. Животных наблюдали на протяжении 30 суток.

Высевы микроорганизмов из крови и органов проводили на агар Хоттингера в чашки Петри. У мышей микробиологический анализ крови, печени и селезенки производили трехкратно за период наблюдения - через 3, 7 и 14 суток после введения изучаемого штамма, у крыс - однократно через 14 суток. Во всех случаях брали по 2 животных каждого вида.

В конце срока наблюдения (30 суток) животных забивали этиловым эфиром, вскрывали и производили макроскопическую оценку внутренних органов: сердца, легких, желудка, печени, почек и селезенки.

В результате проведенных исследований установлено нижеследующее. В течение опыта не зарегистрировано гибели животных. Не отмечено каких-либо изменений в их внешнем виде и поведении. При макроскопической оценке внутренних органов на 30 день наблюдения патологических изменений не обнаружено.

Микробиологический анализ не показал высеваемости микроорганизма из крови и внутренних органов животных после 7 суток исследования.

На основании отсутствия гибели животных и каких-либо изменений в их внешнем виде и общем поведении на протяжении 30-ти дневного наблюдения, отрицательных результатов микробиологического анализа крови, печени и селезенки, нормальной картины внутренних органов животных при вскрытии в конце срока наблюдения сделан вывод, что штамм Bacillus licheniformis ВКПМ В-7038 является непатогенным.

Данные о непатогенности штамма Bac. licheniformis ВКПМ В-7038 представлены в таблице 1.

Анализ таблицы 1 показывает, что предлагаемый штамм является безвредным для животных.

Пример 3. Исследование непатогенности штамма бактерий Bacillus subtilis ВКПМ-7092

Исследование проведено в лаборатории антибактериальных средств и микробиологической токсикологии Всероссийского научного центра по безопасности биологически активных веществ (ВНЦ БАВ).

Патогенность микроорганизма оценивали по выживаемости инфицированных животных, по их внешнему виду и общему поведению, высеваемости бактерий из крови и органов в различные сроки после заражения, а также по макроскопической картине внутренних органов при вскрытии животных в конце срока наблюдения.

В работе использованы лабораторные животные двух видов. Опыты поставлены на 12 нелинейных белых мышах (18-20 г) и 4 белых крысах (180-200 г).

Исследуемый штамм B. subtilis выращен на агаре Хоттингера при 32oC в течение суток. Заражающая доза для животных составляла 10 микробных тел на животное. Микробную взвесь вводили внутрибрюшинно в 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия. Животных наблюдали на протяжении 30 суток.

Высевы микроорганизмов из крови и органов проводили на агар Хоттингера в чашки Петри. У мышей микробиологический анализ крови, печени и селезенки производили трехкратно за период наблюдения - через 3, 7 и 14 суток после введения изучаемого штамма, у крыс - однократно через 14 суток. Во всех случаях брали по 2 животных каждого вида.

В конце срока наблюдения (30 суток) по 2 животных каждого вида забивали этиловым эфиром, вскрывали и производили макроскопическую оценку внутренних органов: сердца, легких, желудка, печени, почек и селезенки.

В результате проведенных исследований установлено нижеследующее. В течение опыта не зарегистрировано гибели животных. Не отмечено каких-либо изменений в их внешнем виде и поведении. При макроскопической оценке внутренних органов на 30 день наблюдения патологических изменений не обнаружено.

Микробиологический анализ не показал высеваемости микроорганизма из крови и внутренних органов животных во все сроки исследования.

На основании отсутствия гибели животных и каких-либо изменений в их внешнем виде и общем поведении на протяжении 30-ти дневного наблюдения, отрицательных результатов микробиологического анализа крови, печени и селезенки, нормальной картины внутренних органов животных при вскрытии в конце срока наблюдения сделан вывод, что штамм Bacillus subtilis IC-16 (ВКПМ В-7092) является непатогенным.

Пример 4. Исследование антагонистической активности штаммов B. subitilis ВКПМ В-7048, ВКПМ В-7092 и B. licheniformis ВКПМ В-7038

Селективно полученный штамм B. subtilis ВКПМ В-7048 характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов.

Антагонистическую активность в отношении тест-культур проверяют методом отсроченного антагонизма. В качестве тест-культур используют Shigella sonnei, Salmonella typhimurium. S. stenly, S. reading, S. derby, Staphylococous aureus, Pseudomonas aeruginose, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Candida albicans, C. tropicalis и др. Используемые тест-микробы должны удовлетворять следующим требованиям: находиться в S-форме, иметь типичные морфологические и ферментативные свойства.

Используемые штаммы тест-микробов давали положительную кератоконъюнктивальную пробу на морских свинках.

Тест-штаммы стафилококков образовывали зону гемолиза размером 3-5 мм вокруг своих колоний через 18-20 часов роста на кровяном агаре, коагулировали плазму крови кролика в течение 2-х часов, вызывали некроз в течение 48-72 часов при внутрикожном введении кролику 200 млн микробных клеток суточной культуры в 0,2 мл физиологического раствора.

Исследование антагонистической активности штаммов B. subtilis ВКПМ В-7048, ВКПМ В-7092 и B. licheniformis ВКПМ В-7038 производят на плотной среде Гаузе N 2.

Рецептура плотной среды Гаузе N 2 на 1 л:

1. Бульон Хоттингера (700 мг% общего азота) - 30 мл

2. Пептон - 5 г

3. Натрия хлорид - 5 г

4. Глюкоза - 10 г

5. Агар микробиологический - 15 г

6. Дистиллированная вода - до общего объема 1 л.

После смешивания компонентов среду разогревают до полного растворения агара и фильтруют через ватно-марлевый фильтр в колбы по 0,3 - 0,4 л. Колбы со средой стерилизуют в автоклаве при давлении 0,1 МПа в течение 15 мин. После остывания до температуры (452)oC среду разливают по стерильным чашкам Петри. Чашки Петри со средой помещают в термостат и выдерживают при температуре (371)oC в течение (242) часов для проверки стерильности.

Культуры Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Candida albicans и другие вышеуказанные тест-культуры выращивают на чашках Петри в течение (18+2) часов на мясопептонном агаре (МПА). В стерильные пробирки приливают по 1 мл физиологического раствора и готовят суспензии тест-штаммов с концентрацией (5,0 0,5)108 клеток/мл.

Для проведения испытания от каждой серии отбирают 4 пробы по 2 г.

Далее 0,5 г препарата на основе штамма B. subtilis 7048 разводят в 1 мл физиологического раствора. Полученную взвесь высевают штрихом с помощью микробиологической петли по диаметру чашки Петри с плотной средой Гаузе N 2. Посевы инкубируют в термостате при (371)oC в течение (722) часов. Затем к выросшей культуре подсеивают посевной материал тест-микробов методом перпендикулярных штрихов.

Учет результатов проводят через 18 часов инкубирования при (371)oC по величине зон отсутствия роста тест-культур. Контролем роста тест-культур служит их параллельный высев на чашки с той же плотной средой Гаузе N 2 без исследуемой ассоциации культур.

Штаммы B. subtilis ВКПМ В-7048 и ВКПМ В-7092 характеризуются следующими показателями зон задержки роста тест-культуры (мм):

Shigella sonnei - 17-22

Salmonella typhimarium - 21-25

S. stenly - 13-17

S. reading - 14-18

S. derby - 15-18

Staphylococcus aureus - 22-27

Pseudomonas fluoresocens - 8-10

Pseudomonas vulgaris - 10-12

Pseudomonas aeruginose - 7-9

Proteus vulgaris - 12-14

Klebsiella pheumoniae - 13-15

Candida albicans - 25-29

C. tropicalis - 22-26

Штамм B. licheniformis 7038 характеризуется следующими показателями зон задержки роста тест-культуры (мм):

Shigella sonnei - 22-27

Salmonella typhimurim - 26-30

S. stenly - 18-22

S. reading - 19-23

S. derby - 20-23

Stapgylococcus aureus - 27-33

Pseudomonas aeruginose - 12-15

Proteus vulgaris - 17-19

Klebsiella pneumoniae - 18-20

Candida albicans - 30-34

C. tropicalis - 27-31

Таким образом исследуемые штаммы бактерий имеют высокую антагонистическую активность в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов.

Кроме того, исследована антибиотическая активность производственных штаммов R. subtilis ВКПМ В-7048, ВКПМ В-7092 и B. licheniformis ВКПМ В-7038 по отношению друг к другу как составных частей комплексных препаратов. При этом можно сделать вывод, что антагонизм клеток B. subtilis и B. licheniformis не является существенной помехой для их совместного использования в препаратах.

Пример 5. Исследование антивирусной активности штамма B. subtilis ВКПМ И-7092

Для исследования антивирусной активности штамм бактерий культивируют на плотной питательной среде следующего состава:

Агар-агар - 20 г/л

Пептон - 12 г/л

Дрожжевой экстракт - 5 г/л

NaCl - 5 г/л

Вода - До 1 литра

Канамицин - 50 г/л

На 1 литр агаризованной среды требуется 25-30 мл бактерий с титром около 108 кл/мл. Питательную среду формируют в емкости в виде слоя, на который укладывают полупроницаемую мембрану, например целлофановую пленку. Сверху на пленку наносят посевную дозу штамма бактерий. Культивирование осуществляют в термостате при температуре 34-37oC в течение 20-24 часов. Далее емкость переносят в термостат с температурой +(6-10)oC и выдерживают при этой температуре в течение 1 суток до образования спор бактерий. При указанном способе культивирования может быть получен титр спор 31010 спор/г. Споры бактерий снимают стеклянным шпателем с поверхности целлофановой пленки и собирают в стерильную емкость. Указанные споры бактерий представляют собой чистый концентрат биомассы, которую исследуют на противовирусную активность.

Противовирусную активность штамма ВКПМ В-7092 определяют по ингибированию цитопатического действия вируса везикулярного стоматита (ВВС) на культуре клеток Л-68.

ВВС предварительно пассируют на куриных эмбрионах по ТУ 42-14-99-77, проводят не менее 3-х пассажей при заражающей дозе 100-1000 ТЦД50/0,1 мл. Инфекционная активность материала должна составлять 1106 - 1107 ТЦД50/мл. Монослой клеток Л-68, выращивают на матраце вместимостью 1000 мл в присутствии ростовой среды (среда Игла MEM с двойным набором ингредиентов - 90% по ФС 42-7ВС-90, сыворотка плодов коровы по ФС 42-7ВС-90-10%) с антибиотиками (канамицин 100 тыс. Ед/мл, гентамицин 16 Ед/мл), после чего клетки снимают со стекла, суспендируют в 40 мл ростовой среды и подсчитывают их количество в счетной камере Горяева. После этого клеточную взвесь разводят ростовой средой из расчета, чтобы в 1,0 мл содержалось 200 тыс. кл/мл. В лунки микропланшетов вносят по 0,1 мл клеточной взвеси и через 2-3 суток инкубации при 37oC получают монослойную культуру.

После сформирования монослоя отсасывают ростовую среду, в первую лунку вносят 20 мкл образца стерильного фильтрата клеток штамма ВКПМ В-7092, полученного как описано выше, и 180 мкл поддерживающей среды; после осторожного перемешивания 100 мкл из первой лунки переносят во вторую лунку, смешивают со 100 мкл поддерживающей среды и т.д. Клетки выдерживают 24 ч при 37oC и после этого в каждую лунку вносят 100 тканевых цитопатических доз, вызывающих поражение в половине проб, вируса ВВС и выдерживают при 37oC 24-48 ч. Через 1 сутки проводят первый учет, через 2 суток - второй. Величину антивирусной активности в исследуемых образцах определяют методом сравнения с антивирусной активностью рефренс-препарата, в качестве которого используют препарат реаферона, и выражают в международных единицах (ME).

Все исследуемые образцы обладают антивирусной активностью 3105-5105ME/л, в то время как в образцах, полученных из бесплазмидного штамма B.subtilis IC-9 антивирусная активность не выявлена.

Пример 6. Определение стабильности рекомбинантной плазмиды рВМВ 5, несущей синтетический ген -2 интерферона человека, в бактериальных клетках B. subtilis ВКПМ В-7092.

Клетки B. subtilis выращивают в среде 2.LB с крахмалом до поздней стационарной фазы, затем переносят в свежую среду и выращивают снова до поздней стационарной фазы и т.д., всего 10 пересевов. После каждого пересева проводят высев на МПА без антибиотика. Выросшие изолированные колонии перекалывают на чашки с МПА с канамицином и без антибиотика на нитроцеллюлозный фильтр. После подращивания подсчитывают и сравнивают число колоний, выросших на МПА с антибиотиком и без антибиотика. Таким образом определяют количество клонов, потерявших рекомбинантную плазмиду после каждого пересева. Отсутствие плазмиды подтверждают методом выделения плазмидной ДНК.

Сохранность гена интерферона человека типа -2 в рекомбинантной плазмиде pВМВ 5 после пересевов подтверждают методом гибридизации. Фильтры с отпечатками колоний после пересевов ингибируют с меченым фрагментом, содержащим ген интерферона типа -2, выделенным из плазмиды рВМВ 5. Все клоны, не потерявшие рекомбинантные плазмиды после пересевов, гибридизируют с меченым фрагментом, содержащим ген интерферона, что свидетельствует о сохранности гена интерферона типа -2 в составе плазмиды рВМВ 5. Кроме того, из случайно отобранных клонов выделяют плазмидную ДНК и анализируют с помощью эндонуклеаз рестрикции.

Установлено, что плазмидная ДНК сохраняется и наследуется в течение 10 пересевов на МПА, что свидетельствует о ее стабильности.

Пример 7. Методика культивирования бактерий рода Bacillus для получения бактериальной биомассы

Для получения биомассы спор бактерий раздельно культивируют штаммы бактерий B.licheniformis ВКПМ-7038, B.subtilis ВКПМ В-7092, B.subtilis ВКПМ В-7048 на плотной питательной среде следующего состава:

Агар-агар - 20 г/л

Пептон - 12 г/л

Дрожжевой экстракт - 5 г/л

NaCl - 5 г/л

Вода - До 1 литра

На 1 литр агаризованной среды требуется 25-30 мл бактерий одного вида с титром (106-10)8 кл/мл. Питательную среду формируют в емкостях в виде слоев, на которые наносят посевные дозы каждого указанного вида бактерий рода Bacillus. Культивирование каждого вида бактерий осуществляют раздельно в термостате при температуре +(34-37)oCo в течение 20-24 часов. Далее емкости переносят в термостат с температурой +(6-10)oC и выдерживают при этой температуре в течение 1-2 суток до образования спор бактерий. При указанном способе культивирования может быть получен титр спор (3-10)1010 спор/г.

Пример 8. Получение готовой формы препарата на основе микробной ассоциации рода Bacillus

Вначале приготавливают раздельно для биомассы каждого вида бактерий смесь сахара с крахмалом в соотношении 1:1. Далее к 5 частям полученной смеси наполнителя добавляют 1 часть биомассы спор бактерий штамма ВКПМ В-7092 или ВКПМ В-7048 и перемешивают При этом происходит иммобилизация спор бактерий на частицах крахмала. Далее в полученную смесь вводят сахар при соотношении биомассы спор бактерий и сахара не более 1:50. В результате получают составные части препарата в сухой форме при следующем соотношении компонентов (мас. %):

1. компонент А

Споры бактерий Bac. subtilis ВКПМ В-7092 с титром не менее 31010спор/г - 0,1-1,0

Крахмал - 1,0-3,0

Сахар - Остальное

2. компонент Б

Споры бактерий Bac.subtilis ВКПМ В-7048 с титром не менее 31010спор/г - 0,1-1,0

Крахмал - 1,0-3,0

Сахар - Остальное

3. компонент В

Споры бактерий Bac. subtilis ВКПМ В-7092 с титром не менее 31010 спор/г - 0,1-1,0

Крахмал - 1,0-3,0

Сахар - Остальное

Далее компоненты А, Б, и В препарата в сухой форме смешивают в соотношении 1:1:1 и получают готовую форму препарата.

Остаточная влажность препарата составляет не более 2-5%

Пример 9. Данные по хранению сухой формы препарата на основе ассоциации спор бактерий рода Bacillus

Для установления срока годности и условий хранения препаратов проведены соответствующие исследования.

Из таблицы 2 следует, что в течение 12 месяцев хранения сухой формы препарата при температуре +24oC титр практически не изменился, что подтверждает высокую термостабильность препаратов в споровой форме, обеспечивающую значительное упрощение технологии их применения в сельском хозяйстве и медицине.

Пример 10. Применение сухой формы препарата на основе ассоциации спор бактерий рода Bacillus

Препарат обладает одновременно антибактериальной и антивирусной активностью за счет высокой антагонистической активности микробной ассоциации опор бактерий рода Bacillus и действия альфа-2-интерферона, а также стимулирует клеточные и гуморальные факторы иммунитета и способен повышать неспецифическую резистентность организма.

Препарат применяют перорально всем видам млекопитающих для лечения и профилактики колибактериозов, дисфункций и дисбактериозов различной природы, чумки, парагриппа, гриппа, диспепсии, сальмонеллезов, инфекционного ринотрахеита крупнорогатого скота, вирусной диареи, ротавирусного энтерита, дизентерии, стафилококковых инфекций, везикулярного стоматита, язвенного дерматита, а также для профилактики иммунодефицитных состояний.

Для лечения препарат назначают перорально в дозе 50 мг/кг массы два раза в сутки с интервалом 12 часов или в дозе 75 мг/кг массы один раз в сутки до выздоровления организма.

Ассоциация бактерий, используемая в препарате, отличается высокой устойчивостью к пищеварительным сокам и ферментам желудочно-кишечного тракта млекопитающих и способностью к быстрому заселению желудка и кишечника. При приеме внутрь с водой или пищей бактерии размножаются в желудочно-кишечном тракте в течение 3-6 суток, затем они полностью выводятся из организма, не вызывая негативных последствий даже при передозировке.

Размножаясь, бактерии своими протеазами лизируют все несвойственные организму млекопитающего белки, денатурированные белки и нуклеопротеиды. При этом уничтожаются бактериальные токсины, элементы опухолевых новообразований и другие дефектные клетки. Здоровые клетки остаются неповрежденными благодаря наличию в них ингибиторов-антиферментов. Бактерии штамма B. subtilis ВКПМ В-7092 в процессе своей жизнедеятельности вырабатывают интерферон. Через стенки кишечника интерферон попадает в кровь. При этом повышается фагоцитарная активность лейкоцитов крови, повышается иммунный статус организма и устойчивость к различным видам вирусных и других заболеваний. Стабилизируются регенерационные процессы тканей организма. Нормализуется обмен веществ. Стимулируется гуморальный иммунный ответ, а антигенреактивные Т-лимфоциты активизируют функции перитонеальных макрофагов.

Пример 11. Исследование эффективности лечения чумы плотоядных

Для этого из заболевших собак с диагнозом кишечная форма чумы плотоядных в начальной стадии было сформировано 1 контрольная и 4 опытных группы по 5 животных в каждой (табл. 3).

Схема опытов при лечении чумы плотоядных

Лечение по предлагаемому способу проводили в течение 5-6 дней. После исчезновения клинических признаков животным предлагаемый препарат в течении 3-5 дней вводили перорально однократно через двое суток с целью профилактики возможных рецидивов. В контрольной группе для лечения применяли сыворотку гипериммунную, -глобулины, антибиотики, сульфаниламиды, витамины, сердечные.

Результаты лечения чумы плодоядных

При применении предлагаемого способа эффективность лечения кишечной формы чумы собак повышается. Причем просматривается прямая зависимость между дозой предлагаемого препарата и выраженностью его терапевтического эффекта. Так, при назначении препарата в дозе 50 мг/кг массы через 12 часов и в дозе 75 мг/кг раз в сутки получены оптимальные результаты. При лечении животных больных чумой с использованием предлагаемого препарата в указанных выше дозировках достигнут 100% положительный эффект без применения традиционных сывороток и иммуноглобулинов. Улучшение в течении заболевания наблюдается уже на 2-3 сутки и в дальнейшем болезнь протекает в более легкой форме в сравнении с аналогами из контрольной группы.

Под влиянием лечения предлагаемым способом происходит функциональная перестройка организма позитивного характера. Стимулируются функции жизненно важных органов и систем. Повышаются окислительно-восстановительные процессы и активизируется обмен веществ. Увеличение количества лимфоцитов и лейкоцитов может свидетельствовать о повышении защитных функций организма собак.

В контрольной группе при использовании комплексной терапии заболевание протекало тяжело и продолжительность лечения колебалась в пределах (10 -12) дней.

Таким образом, предлагаемый способ является эффективным при лечении кишечной формы чумы собак в начале заболевания. Оптимальные результаты получены при использовании препарата в дозе 50 мг/кг массы через 12 часов и в дозе 75 мг/кг массы раз в сутки.

Пример 12. Исследование эффективности лечения парвовирусного энтерита

Для изучения эффективности предлагаемого способа при лечении парвовирусного энтерита собак также были сформированы 1 контрольная и 4 опытных группы по 5 собак в каждой с диагнозом парвовирусный энтерит (табл. 4).

Продолжительность лечения определялась наличием симптомов заболевания. После исчезновения клинических признаков, с учетом особенностей течения заболевания, переболевшим животным в течении 3-4 дней продолжали проводить профилактический курс в дозе 50 мг/кг, один раз в две суток. Животным всех опытных групп назначали регидратационные средства.

Для лечения животных контрольной группы применяли сердечные, противоспазмолитические и противорвотные препараты, антибиотики, регидратационные средства и гиперимунную сыворотку.

Критериями оценки эффективности курса лечения служили продолжительность, характер и степень тяжести течения заболевания, исход, изменения морфологических показателей крови животных. Кровь у собак исследовали до назначения лечения, в период лечения (на 5 день) и после выздоровления.

Результаты лечения парвовирусного энтерита

При парвовирусном энтерите собак предлагаемый способ оказывает выраженное терапевтическое действие. Оптимальные результаты получены при назначении препарата внутрь, в начальный период заболевания, в дозах 50 мг/кг массы через 12 часов и в дозе 75 мг/кг массы 1 раз в сутки до выздоровления животных.

Продолжительность лечения парвовирусного энтерита предлагаемым способом с использованием препарата в дозах 50 мг/кг массы через 12 часов и в дозе 75 мг/кг массы 1 раз в сутки в зависимости от тяжести заболевания колебалась от 2 до 5 дней.

Под влиянием предлагаемого препарата изменяется характер проявления и развития патологического процесса. При назначении препарата в начальной стадии заболевания, воспаление кишечника носило преимущественно катаральный характер и у собак отсутствовали геморрагические выделения. Одним из основных клинических симптомов при парвовирусном энтерите является резкое угнетение лейкопоэза. Предлагаемый способ исключает развитие лейкопении. В меньшей степени у животных развиваются явления интоксикации и дегидратации организма.

Под влиянием предлагаемого препарата профилактируется развитие других вирусных инфекций собак (чума, гепатит) и вторичных бактериальных инфекций, которые часто наблюдаются у собак, переболевших парвовирусным энтеритом, и, как правило, часто приводят к летальному исходу.

У животных контрольной группы заболевание протекало со средней степенью тяжести, преимущественно с геморрагическим воспалением кишечника и выраженной лейкопенией. Продолжительность лечения животных контрольной группы, в зависимости от тяжести заболевания колебалась от 5 до 7 дней.

Пример 13. Исследование эффективности профилактики поросят предлагаемым способом

В опыте использовались две свиноматки с пометом в возрасте 19 дней. Поросятам опытной группы внутрь назначали препарат в дозе 50 мг/кг через 12 часов в течении 5 дней. Поросятам контрольной группы препарат не вводили. В опытной группе было 9 поросят, а в контрольной - 10 поросят.

Для определения эффективности профилактического действия препарата в крови определяли содержание эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина, РОЭ, лейкограмму, субпопуляции Т-лимфоцитов, IgM и IgG. Также учитывали показатели сохранности поросят до отъема. В случае заболевания поросят устанавливали продолжительность, характер течения и исход заболевания.

При исследовании крови поросят до введения препарата не регистрировалось характерных различий морфологических и иммунологических показателей сыворотки крови животных опытной и контрольной групп (таблицы 5, 6).

Результаты исследования крови на 10-й день эксперимента свидетельствуют об увеличении количества эритроцитов на 14,2% и содержания гемоглобина на 10%. Содержание лейкоцитов повышалось на 32,7%, сегментоядерных нейтрофилов на 18% и лимфоцитов на 9% в сравнении с аналогами из контрольной группы (табл. 7).

Как у поросят опытной, так и контрольной группы количественные изменения всех субпопуляций Т-лимфоцитов, IgM и IgG происходят в сторону их увеличения, что обусловлено возрастной спецификой. Однако у животных опытной группы эти показатели были значительно выше, чем у аналогов из контрольной группы (табл. 8).

Таким образом предлагаемый препарат стимулирует образование и выход:

- малодифференцированных Т-лимфоцитов;

- функционально зрелых Т-индукторов-хелперов и Т-киллеров

- супрессоров;

- Т-активных лимфоцитов.

Под влиянием препарата в крови увеличивается содержание IgG. Следовательно препарат в предлагаемом способе повышает естественную резистентность организма, активизируя Т- и В-звенья иммунитета. Препарат интенсивнее стимулирует факторы клеточного иммунитета и в меньшей степени влияет на гуморальные факторы. В крови опытных поросят значительно увеличивается содержание Т-киллеров-супрессоров (на 32%), повышается активность Т-лимфоцитов (на 51,7%), увеличивается содержание посттимических предшественников функционально зрелых клеток (на 58,5%). Концентрация IgG в крови увеличивается на 20,8% в сравнении с контролем. Уменьшение содержания IgM в опытной группе связано с тем, что они вероятно принимают участие в антигенно зависимой клеточной цитотоксичности и интенсивно фиксируются клетками-киллерами и антигенами, а следовательно, их выход в реакции радиальной простой иммунодиффузии ниже.

Поросята в опытной группе не болели, лучше росли и развивались. Сохранность поросят в опытной группе составила 100%, а в контрольной группе - 83,3%. Средний прирост живой массы на период отъема в контрольной группе равнялся (14,5 + 4,45) кг, в опытной - (15,2 + 1,35) кг. Следовательно в опытной группе средний прирост живой массы на 4,83% выше аналогов из контрольной группы. В опытной группе интенсивность роста поросят была равномерной, за исключением одного поросенка, разница в приросте составляла 1 кг, а в контрольной группе - до 8 кг.

Животные хорошо переносят препарат, побочных отрицательных явлений у поросят не наблюдалось.

Пример 14. Исследование эффективности профилактики телят предлагаемым способом

Для проведения исследования были сформированы опытная и контрольная группы по пять животных в каждой группе в возрасте семь дней. Телятам опытной группы вводили предлагаемым способом препарат на основе Bac. subtilis в дозе 50 мг/кг массы через 48 часов в течение 20 дней.

Животным контрольной группы препараты не вводили.

Критериями оценки эффективности профилактики предлагаемым способом в сравнении с контролем служили: изменения уровня гемоглобина в крови, эритроцитов, лейкоцитов, субпопуляций Т-лимфоцитов и данных лейкограммы; общее состояние телят; показатели по заболеваемости телят.

Т-лимфоциты определяли с использованием метода спонтанного розеткообразования, основанного на взаимодействии мембранного Е-рецептора Т-лимфоцитов с эритроцитами барана.

Результаты исследований. При исследовании крови телят до проведения профилактических мероприятий не регистрировалось характерных различий морфологических и иммунологических показателей сыворотки крови животных опытной и контрольной групп. Анализы показали низкое содержание в крови животных активированных Т-лимфоцитов и посттимических предшественников.

Далее исследования показывают, что в процессе проведения профилактики, как у телят опытной, так и контрольной групп количественные изменения гематологических показателей и всех популяций Т-лимфоцитов происходят в сторону их увеличения, что обусловлено возрастной спецификой. Однако у животных опытной группы происходили более выраженные их изменения, в сравнении с контролем.

У телят опытной группы при исследовании крови через 10 дней после начала профилактики по сравнению с контролем увеличивается уровень лейкоцитов на 6,2%, содержание лимфоцитов на 6,6%, тЕ-рок - на 51,85%, рЕ-рок на 43,3%, вЕ-рок на 67,2%, бЕ-рок на 168,2% и аЕ-рок на 225%.

На 20 день исследования из изучаемых гематологических показателей в сравнении с контролем в опытной группе регистрировалось увеличение лимфоцитов на 14,6% и лейкоцитов на 6,3%, а исследование крови на содержание субпопуляций Т-лимфоцитов показало увеличение соответственно содержание тЕ-рок на 18,1%, рЕ-рок на 10,6%, вЕ-рок на 33,7%, бЕ-рок на 34,1%, аЕ-рок на 40,5%.

Промышленная применимость. Изобретение может быть использовано в медицине, ветеринарии и биотехнологии.

Источники научно-технической и патентной информации:

1. Авт. свид. СССР N 681923, МКИ C 12 N 15/00, опубл. 1979 г.

2. Авт. свид. СССР N 1722502, МКИ A 61 K 39/02, 1989 г.

3. Патент РФ N 1839459, МКИ C 12 N 1/21, опубл. 1995 г.

4. Заявка ЕПВ N 0287699, МКИ C 12 N 1/20, опубл. 26.10.88 г.

5. Авт. свид. СССР N 1398868, МКИ A 61 K 35/74, опубл. 1988 г.

6. Chang S. , Cohen S.N. High frequency transformationof Bac. subtilis protoplasts by plasmid DNA.-Mol. Gen. Genet., 1976, v. 168, p. 111 - 115.

7. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. - М., "Медицина", 1978. - с. 47.

8. Birnboim H. C. , Doly J. A rapid alkaline eatraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. - Nucleic Acids Res., 1979. - v. 7, p. 1513 - 1523.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-7092, используемый в качестве компонента препарата против вирусных и бактериальных инфекций.

2. Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-7048, используемый в качестве компонента препарата против вирусных и бактериальных инфекций.

3. Штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В-7038, используемый в качестве компонента препарата против вирусных и бактериальных инфекций.

4. Препарат против вирусных и бактериальных инфекций, включающий смесь биомассы штаммов бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis в равных соотношениях, отличающийся тем, что он дополнительно содержит крахмал и сахар, а в качестве биомассы штаммов бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis используют биомассу штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-7092, ВКПМ В-7048 и Bacillus licheniformis ВКПМ В-7038 в споровой форме с титром не менее 31010 спор/г при следующем количественном соотношении компонентов, мас. %:

Смесь спор бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis в равных соотношениях - 0,1 - 1,0

Крахмал - 1,0 - 3,0

Сахар - Остальное

краткое изложение информации для тех кто в науках не шарит.

вы добровольно заражаете себя штаммами бактерий который был сконструирован военными микробиологами советского союза. эти штаммы живут в вас и синтезируют активные вещества которые влияют на ваш организм и на патогенные организмы попадающие в вашу пищеварительную систему.

как, мало кто знает 😊

в тексте патента, авторы об этом деликатно умалчивают, сводя все рассуждения к забавным отпискам.

если конкретно, то шняга содержится в этом месте

При приеме внутрь с водой или пищей бактерии размножаются в желудочно-кишечном тракте в течение 3-6 суток, затем они полностью выводятся из организма, не вызывая негативных последствий даже при передозировке.

Размножаясь, бактерии своими протеазами лизируют все несвойственные организму млекопитающего белки, денатурированные белки и нуклеопротеиды. При этом уничтожаются бактериальные токсины, элементы опухолевых новообразований и другие дефектные клетки. Здоровые клетки остаются неповрежденными благодаря наличию в них ингибиторов-антиферментов. Бактерии штамма B. subtilis ВКПМ В-7092 в процессе своей жизнедеятельности вырабатывают интерферон. Через стенки кишечника интерферон попадает в кровь. При этом повышается фагоцитарная активность лейкоцитов крови, повышается иммунный статус организма и устойчивость к различным видам вирусных и других заболеваний. Стабилизируются регенерационные процессы тканей организма. Нормализуется обмен веществ. Стимулируется гуморальный иммунный ответ, а антигенреактивные Т-лимфоциты активизируют функции перитонеальных макрофагов.

про интерферон верно, в то же время интерферон деградирует в ЖКТ. есть рекомбинантные интерфероны устойчивые в пищеварительной системе, получене СССР (разработка ГосНИИ ОЧБ, еще одного военного предприятия). про то, что Bacillus subtillis экспрессирует рекомбинантный интерферон, в патенте не сказано, что опять же наводит на странные мысли.

однако, могу сказать точно, что даже рекомбинантный интерферон не нормализует обмен веществ, влияние его на регенерационные процессы тканей организма так же сомнительно.

то, что передозировка не возможна, мне кажется транным, ровно и как возможность полной элиминации бактерий из организма в течение 3-6 суток, а если штамм станет адгезивным то никуда он не денется

еще, фишка тут состоит в том, что бактериям свойственно явление под названием горизонтальный перенос генов. явление к настоящему времени малоизученное и не поддающееся контролю. суть его заключается в том, что бактерии способны обмениваться генетической информацией между собой приобретая разные неожиданные свойства.

так вот, вам предлагают заразиться ПОЧВЕННОЙ бактерией которая не свойственна человеку - не является естественной для его желудочно-кишечного тракта. бактерией достаточно агрессивной (судя по описалову выше). все бы ничего, но фишка в том, что как раз почвенным бактериям свойственна высокая способность к активному обмену генетической информацией. если это произойдет и штаммы bacillus subtilis в ваших кишках получат гены патогенности + гены антиботикорезистентности (гены устойчивости к канамицину и ампициллину они уже имеют), то вам грозит незавидная учесть - вас вряд ли вылечат 😀

почему, в подробности вдаваться не буду, можете мне просто поверить на слово 😊

для солдата, в условиях биологической войны это не важно, ему по любому жить пару недель, максимум, а вам?

вот интересная статейка, подтверждающая мой скептецизм. по поводу безопасности изобретения - выделено в тексте жирным. у дураков, мысли сходятся, что называется 😀

ну и дальше там рассказывается про механизм действия интерферона от bacillus subtillis 😊

Конструирование генно-инженерных препаратов - пробиотиков и их безопасность

В.М.Бондаренко, В.А.Белявская
НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН, Москва;
НИИ биоинженерии ГНЦ вирусологии и биотехнологии "Вектор", Кольцово, Новосибирской обл

Молочнокислые бактерии, в том числе представители родов Lactobacillus, Streptococcus и Lactococcus, благодаря своей безопасности для человека и их широкому использованию в пищевой и фармацевтической промышленности, давно привлекают внимание специалистов в генной инженерии. Однако использованию молочнокислых бактерий в качестве объектов для клонирования препятствует слабая по сравнению с другими классическими объектами (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae) генетическая изученность и отсутствие подходящих векторов для клонирования. Сама процедура трансформации до недавнего времени была трудоемкой и мало эффективной.

Использование электропорации во многом способствовало развитию генной инженерии лактобацилл и лактококков и усовершенствованию методов клонирования. Кроме молочнокислых бактерий поименованных выше, к этой же группе принадлежат и представители родов Leuconostoc, Pediococcus, Micrococcus и др. Определенная степень геномного родства многих из указанных видов бактерий позволяет конструировать и использовать векторы на основе известных плазмид, арсенал которых достаточно широк.

Большой интерес для медицинской практики представляют данные по использованию генетически модифицированных микроорганизмов, перспективных для конструирования препаратов-пробиотиков, обладающих максимальным спектром заданных полезных свойств. К таким свойствам относится продукция бактериями антибиотикоподобных и различных целевых белков иммунокомпетентных клеток человека, гены которых клонированы на различных векторах и переданы в определенный штамм-носитель.

В настоящее время насчитываются десятки рекомбинантных штаммов микроорганизмов, несущих гены, ответственные за синтез α, β и γ-интерферонов, различного типа интерлейкинов (ФНО-α и β, ИЛ-1, ИЛ-6, α-1 тимозина, гранулоцит-макрофаг колоний стимулирующего фактора и др.).
Одно из наиболее современных и интенсивно разрабатываемых направлений при создании генно-инженерных препаратов-пробиотиков нацелено на использование живых бактериальных векторов доставки гетерологичных иммуногенных эпитопов, сочетающихся с доставкой цитокинов, индуцирующих местный протективный иммунитет.

Для лечебно-профилактических препаратов, создаваемых на основе бактериальных векторов доставки, преимуществом является простота изготовления, не требующая дорогостоящей очистки лекарственной субстанции и заключающейся в получении биомассы, с последующей ее сублимацией, что в свою очередь обеспечивает простоту их хранения. Пероральный прием также является наиболее простым и безопасным способом введения таких препаратов.

Многие исследователи подчеркивают, что эффективность доставки целевого белка в организм бактериальным вектором зависит от многих факторов: природы и способа введения бактерии-носителя, эффективности экспрессии гетерологичных эпитопов и цитокинов в иммунологически активной форме.

Однако широкое внедрение в медицинскую практику генно-инженерных штаммов ограничено возможным их пока непредсказуемым влиянием на организм теплокровных и экологию окружающей среды. Полагают, что это может быть связано с появлением у интродуцента новых свойств, способствующих усилению его конкурентной способности, и возможностью нарушения равновесия экосистем. Кроме этого дискутируется возможность неконтролируемого переноса клонированной ДНК "новым хозяевам. Многие исследователи отмечают сохраняющийся разрыв между теоретическими концепциями, описывающими возможные негативные последствия внедрения генетически модифицированных микроорганизмов в практику и экспериментальными данными, подтверждающими их экологическую безопасность.

Цель настоящего сообщения - анализ данных по биологической безопасности и эффективности генно-инженерных бактерий Bacillus subtilis 2335/рВМВ-105, синтезирующих α-2-интерферон человека.
Данные о биобезопасности бактерий B.subtilis 2335/105, продуцирующих α-2 интерферон человека.
Для экспериментального изучения "судьбы" генетически модифицированного штамма B.subtilis Inf+ в кишечном тракте теплокровных с целью оценки возможности спонтанной передачи рекомбинантной плазмиды рВМВ-105, несущей клонированные гены интерферона и маркер устойчивости к канамицину, от интродуцента бактериям нормальной микрофлоры в качестве реципиентов нами были выбраны лактобациллы, как представители доминирующего звена желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Вначале из коллекции лактобацилл были отобраны штаммы, чувствительные к канамицину.

Следует отметить, что устойчивость к канамицину широко распространена среди различных видов молочнокислых бактерий, в том числе колонизирующих ЖКТ. Получить трансформанты лактобацилл, содержащие гибридную плазмиду pBMB-105(Kmr), контролирующую синтез интерферона, удалось лишь путем электропорации. Эффективность трансформации при этом составила менее 102 клеток на 1 мкг плазмидной ДНК. Полученные результаты свидетельствуют о наличии риска "горизонтального переноса" ДНК. Однако электропорация является искусственным способом введения гетерологичной ДНК, не имеющим ничего общего с естественными процессами переноса ДНК.

В последующих экспериментах при изучении выживаемости интродуцента, определенной в динамике после оральной аппликации штамма-интродуцента с учетом времени его пребывания в кишечном тракте (от момента введения до полной элиминации) путем высева из фекалий мышей, телят и цыплят, было показано, что клетки B.subtilis Inf+ не приживаются в кишечнике теплокровных, а полностью элиминируются из организма в течение 2-3 дней у мышей, 4-5 дней у цыплят и 5-7 дней у телят (рис. 1).

Рис. 1. Выживание бактерий B.subtilis Inf+ в организме теплокровных

Влияние интродуцента на нормальный микробиоценоз кишечного тракта мышей, изученное по изменению численности доминирующих микробных популяций, присутствующих у клинически здоровых мышей, показало, что после 3-кратного (1-й, 3-й и 7-й день) введения клеток B.subtilis Inf+ численность и соотношения в доминирующих таксономических группах нормофлоры остались практически неизменными (бифидобактерии - 108 КОЕ/г фекалий, энтерококки - 106 КОЕ/г, эшерихии - 105 КОЕ/г, лактобактерии - 104-105 КОЕ/г.

При этом была отмечена высокая стабильность популяционного уровня лактобактерий. Было исследовано также влияние интродукции B.subtilis Inf+ на количественный и качественный состав нормофлоры телят. У 6 телят до интродукции B.subtilis Inf+ показатели были в пределах нормы и остались таковыми в течение всего срока наблюдения после перорального введения интродуцента. Эти данные свидетельствуют об отсутствии негативного влияния интродукции генетически модифицированных бактерий B.subtilis Inf+ на микроэкологию ЖКТ животных.

Важными были эксперименты по оценке возможности "горизонтального переноса" гетерологичной ДНК, проведенной на мышах после бактериологического подтверждения полной элиминации интродуцента из организма. Широкое распространение канамицинустойчивости (Kmr) среди молочнокислых бактерий, наиболее вероятных реципиентов автономной плазмидной ДНК, не позволило использовать Kmr для поиска спонтанных трансформантов.

Поэтому воспользовались приемом, который состоял в выделении тотальной ДНК из бактерий природных популяций (представителей родов Bacillus, Bifidobacterium, Lactobacillus и Clostridium) с последующим проведением ПЦР при использовании специфических к изучаемому гену праймеров. Полученные результаты показали отсутствие данного гена в составе тотальной ДНК возможных реципиентов.

Далее были созданы модели гетеротрофных микроэкологических систем (МЭС), характеризующиеся наличием эндогенной микрофлоры, различных микроводорослей, инфузорий и дафний, состав и количество которых остается стабильным с небольшими сезонными и суточными изменениями после определенного установочного периода. Конструирование таких МЭС позволяет создать условия, максимально приближенные к естественным средам обитания. Гетеротрофные МЭС характеризуются наличием питательных субстратов, циркулирующих в виде продуктов жизнедеятельности живых сообществ. В наших экспериментах были использованы два типа гетеротрофных МЭС, отличающихся длиной трофических звеньев. Изучение последствия интродукции B.subtilis Inf+ в модельных водных экосистемах (микрокосмах) показало, что применение генетически модифицированных бактерий практически безопасно для окружающей среды, как в плане распространения генов Kmr, так и негативного влияния на водные микробиоценозы (табл. 1).

Таблица 1 Состав и численность трофических звеньев модельных микрокосмов

Иммуномодулирующее действие бактерий B.subtilis Inf+.

Известно, что под влиянием нормальной микрофлоры усиливается активность клеток моноцитарно-макрофагального ряда, цитотоксическая активность натуральных киллеров и макрофагов, увеличивается продукция ИФ-α, ФНО-α, ИЛ-1 и ИЛ-6. Известно, что для большинства возбудителей инфекционных болезней слизистые желудочно-кишечного, урогенитального и респираторного трактов являются входными воротами инфекции, в связи с чем, индукция местного иммунного ответа является важной составляющей защиты организма от развития инфекционного процесса.

Многочисленные исследования показали высокую эффективность препаратов-пробиотиков при использовании оральных способов их введения, который является физиологически целесообразным. В силу физиологической общности иммунной системы слизистых, стимуляция иммунокомпетентных клеток ЖКТ сопровождается активацией иммунных реакций всех слизистых организма хозяина, предшествующей системному иммунному ответу организма.

При внеклеточной локализации возбудителя, как правило, обычно развивается гуморальный иммунный ответ, в основе которого лежит пролиферация В-лимфоцитов и синтез специфических иммуноглобулинов под действием цитокинов, продуцируемых Т-хелперами 2 типа (Th1), внутриклеточные же паразиты вызывают развитие клеточного иммунного ответа на основе формирования популяций антиген (АГ)-специфических Т-хелперов 1 типа (Th1) и цитотоксических Т-лимфоцитов.

Поскольку для развития АГ-специфического иммунного ответа требуется достаточно длительный период, более ранняя защита от инфекции обеспечивается как факторами естественной резистентности, реагирующими на проникший возбудитель мгновенно, к которым относятся макрофаги (МФ), нейтрофилы (НФ), естественные киллеры (ЕК) и IgG, так и быстро развивающимся индуцибельным неспецифическим ответом за счет активированных клеток системы естественной цитотоксичности (ЕЦ), цитокинов, а также регионарных γδ-Т клеток, рассматриваемых в качестве ранней АГ-специфической реакции. Вирусы неспецифически активируют неиммунные клетки (эпителиоциты) и антиген-представляющие клетки (макрофаги или дендритные клетки) слизистой к секреции высоких уровней ИФ-α, который является наиболее ранним ключевым цитокином, обеспечивающим наряду с другими цитокинами (ИЛ-1, ФНО-α, ИЛ-12, ИЛ-18) включение индуцибельных противоинфекционных механизмов.

Взаимодействуя со специфическими рецепторами клеток, ИФ-α способен, во-первых, индуцировать синтез антивирусных белков, приводящих к блокированию в этих клетках размножение вирусов, во-вторых, - неспецифически активировать эффекторы естественной цитотоксичности к цитолизису вирусинфицированных клеток, индуцировать местную и системную продукцию эндогенного интерферона, и, наконец, усиливать процесс взаимодействия антиген-представляющих клеток (АПК) с Т-клетками.

Установлено, что ИФ-альфа, синтезируемый АПК в процессе презентации антигена Тh0- лимфоцитам, индуцирует экспрессию специфического рецептора ИЛ-12 Rb1/b2 на Тh0 - клетках, обеспечивая их ответ на ИЛ-12, который, в свою очередь, стимулирует экспрессию рецепторов к ИЛ-18 на Т - лимфоцитах. ИЛ-18, синтезируемый АПК при стимуляции ИФ-альфа, приводит к ИЛ-18 - зависимой продукции Т - клетками ИФ-альфа, необходимого для развития Тh1 иммунного ответа. ИФ-альфа также активирует макрофаги для цитолиза вирус-инфицированных клеток. Все вышесказанное позволяет рассматривать ИФ-альфа как ключевой цитокин, являющийся связующим звеном между неспецифическим и адаптивным ответом организма на возбудитель, обеспечивающий формирование клеточного иммунитета.

Интерферон, появляющийся в просвете кишечника при пероральном введении, реализует свою биологическую активность через контактное взаимодействие с рецепторами эпителиальных клеток слизистой и иммунных клеток пейеровых бляшек. Не исключается и прямое проникновение интерферона в кровоток путем физиологического всасывания. Отмечается, что не высокие, а именно низкие дозы орально вводимого интерферона оказывают терапевтическое и иммунотропное действие. Принимая во внимание инициирующую позицию ИФ-альфа в цитокиновом каскаде, можно полагать, что его пероральное введение воспроизводит праймирующее действие индуцируемого в организме возбудителем эндогенного интерферона, являющегося связующим звеном между неспецифической резистентностью и антиген-специфическим иммунным ответом.

Показано, что противовирусное действие орально вводимого интерферона связано с его системным иммуномодулирующим эффектом. Адъювантный эффект орального ИФ-альфа в отношении индукции ИЛ-12, ИЛ-18, ИФ-γ, необходимых для Тh1 иммунного ответа, и его способность повышать выживаемость ранних клеток памяти на АГ, является определяющим в формировании специфического противовирусного иммунитета.

Разработка оральных форм интерферона продиктована необходимостью защиты лекарственной субстанции от деградирующего влияния протеолитического содержимого секретов слизистых трактов, при этом используются таблеточные, инкапсулированные и липосомальные формы. Альтернативным способом доставки интерферона к слизистым поверхностям являются препараты на основе живых рекомбинантных бактерий, продуцирующих интерферон. Иммунологическая активность B.subtilis Inf+ была показана в исследованиях на добровольцах (табл. 2).

Таблица. 2 Пролиферативная активность лимфоцитов и продукция цитокинов мононуклеарами крови добровольцев при пероральном приеме B.subtilis Inf+ (X +m)

По-видимому, перорально вводимые клетки рекомбинантного штамма B.subtilis Inf+ продвигаясь под действием перистальтики по ЖКТ, стимулируют синтез интерферона вблизи клеток-мишеней, локализующихся в слизистой. У мышей, инфицированных вирусом гриппа А и вирусом герпеса, было показано терапевтическое преимущество рекомбинантных бактерий по сравнению с исходным штаммом. В экспериментах с использованием модельной инфекции генитального герпеса у морских свинок антивирусная активность препарата отмечена при его применении в виде местных аппликаций.

Антивирусный эффект B.subtilis Inf+ связан с продукцией активированными иммунокомпетентными клетками эндогенного интерферона. Активирующее влияние B.subtilis Inf+ на перитонеальные макрофаги было оценено по их способности ингибировать пролиферацию опухолевых тест-клеток in vitro. Установлено, что введение здоровым животным и мышам с трансплантированными злокачественными опухолями оказывает выраженное антиметастатическое действие [6].

Пероральное введение B.subtilis Inf+ приводит к системной активации клеток-эффекторов периферических органов иммунной системы, удаленных от ЖКТ, при этом противоопухолевое и антиметастатическое действие не проявляется у «бестимусных» мышей, что свидетельствует о важной роли Т-лимфоцитов в системной активации иммунокомпетентных клеток периферических органов иммунной системы. Наблюдается также значительное повышение пролиферативной активности Т-лимфоцитов в селезенке интактных животных и в крови здоровых добровольцев.

В заключении следует отметить, что генетически модифицированные бактерии B. subtilis Inf+при пероральном применении синтезируют интерферон, проявляющий иммуностимулирующее, антивирусное и противоопухолевое действие. На основании результатов, полученных в экспериментах на теплокровных и на модели водных микроэкологических систем (микрокосмах), можно отнести полученные генно-инженерные бактерии к экологически безопасным микроорганизмам. По своему позитивному эффекту генно-инженерные бактерии, продуцирующие интерферон человека, являются обнадеживающими в плане их использования в качестве лечебно-профилактических препаратов-пробиотиков.

Литература
1. Белявская В.А., Кашперова Т.А., Бондаренко В.М. и др. Экспериментальная оценка биобезопасности генно-инженерных бактерий на модели штамма Bacillus subtilis, продуцирующего интерферон. Журн. микробиол. 2001,2:16-20.
2. Белявская В.А., Чердынцева Н.В., Бондаренко В.М. и др. Биологические эффекты интерферона, продуцируемого рекомбинантными бактериями препарата-пробиотика субалина. Журн. микробиол. 2003,2:102-109.
3. Бондаренко В.М., Белявская В.А. Клонирование и экспрессия генов в молочнокислых бактериях. Журн. микробиол. 2000, 2:67-73.
4. Бондаренко В.М., Рубакова Э.И., Лаврова В.А. Иммуномодулирующее действие лактобактерий, используемых в качестве основы препаратов пробиотиков. Журн. микробиол. 1998,5:107-112.
5. Сорокулова И.Б., Белявская В.А., Масычева В.И. и др. Рекомбинантные пробиотики: проблемы и перспективы использования для медицины и ветеринарии. Вестн. РАМН. 1997, 3:46-49.
6. Литвяков Н.В., Чердынцева Н.В., Белявская В.А и др. Роль макрофагов в реализации антибластомного действия рекомбинантного пробиотика субалина. Вопр. онкологии. 2001,47(1):86-89.
7. Чердынцева Н.В., Литвяков Н.В., Белявская В.А. и др. Влияние рекомбинантного пробиотика субалина на функциональную активность иммунокомпетентных клеток. Бюлл. экспер. биол. 1999, 127(прилож. 1): 67-70.
8. Medaglini D., Pozzi G., King T.P. et al. Mucosal and systemic immune responses to recombinant protein expressed on the surface of the oral commensal bacterium Streptococcus gordonii after oral colonization. Proc. Natl. Sci. USA. 1995, 92:6868-6872.
9. Steidler L., Robinson K., Chamberlain L. et al. Mucosal delivery of murine IL-2 and IL-6 by recombinant strains of Lactococcus lactis coexpressing antigen and cytokine. Infect. Immun. 1998, 66:3183-3189.
10. Tovey M.G., Maury C. Oral mucosal interferon therapy: мarked antiviral and antitumor activity. J. Interferon Cytokine Res.1999, 19:145-147.

еще немного. авториферат диссертации

Конструирование пробиотиков на основе генетически модифицированных штаммов Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы Основной проблемой последних лет является увеличение числа резистентных к антибиотикам инфекций и снижение эффективности ряда антибиотиков. Распространение бактерий, устойчивых к антибиотикам, влечет за собой массовую аллергизацию больных и развитие дисбактериозов, частота которых быстро растет /Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1997,2000; Митрохин С.Д., 2004/.
В последние годы появились новые подходы к лечению дисбактериозов, связанные с восстановлением естественной экологии организма и основанные на использовании активных биологических продуктов. Одним из аспектов такого подхода является нормализация измененного микробного пейзажа организма при помощи бактерийных препаратов /Мирошник O.A., 1997; Бондаренко В.М. и др., 1998; Янковский Д.С. и др., 2004/.
В настоящее время в клинической практике в качестве средств лечения и профилактики острых кишечных инфекций, дисбактериозов различной этиологии и стресса широко используются биопрепараты из живых микробных культур - пробиотики. В отличие от антибиотиков, они не оказывают отрицательного воздействия на нормальную микрофлору, безвредны, экологически чисты и не имеют противопоказаний для применения. Основой пробиотиков являются либо микроорганизмы, представляющие нормальную микрофлору, либо не характерные для нормофлоры сапрофиты, способные вытеснять патогенные микроорганизмы из просвета кишечника. Пробиотические штаммы бацилл являются неадгезивными транзисторными представителями микрофлоры кишечника. Некоторые полезные свойства делают их важным арсеналом совершенствования биопрепаратов. Прежде всего, это высокая ферментативная активность, позволяющая им существенно регулировать и стимулировать' пищеварение, а также способность оказывать противоаллергенное, антитоксическое действие и повышать неспецифическую резистентность макроорганизма /Сорокулова И.Б., 1998;
5
Oggioni M.R. et al., 2003; Ouwehand AC. et al., 2003/. Антагонизм в отношении широкого круга патогенных и условнопатогенных микроорганизмов и самостоятельная элиминация из желудочно-кишечного тракта, делает конструирование лечебно-профилактических препаратов из пробиотических бацилл особенно перспективным.
Среди существующих в настоящее время пробиотиков нет высокоэффективных средств, характеризующихся выраженной антивирусной активностью. В то же время известно, что заболевания вирусной и вирусно-бактериальной этиологии составляют значительную часть инфекционной патологии человека и животных. Вирусные инфекции, как правило, осложняются бактериальными и наоборот. Поэтому представляется весьма актуальной проблема разработки средств, характеризующихся одновременно антибактериальными и антивирусными свойствами. Для ее решения пробиотики используют в сочетании с различными иммуностимуляторами, антивирусными веществами и цитокинами, среди которых наиболее широко представлены препараты интерферона. Однако этот подход усложняет технологию производства и повышает цену, что часто делает такие комплексные препараты нерентабельными, поэтому в реальной практике они имеют ограниченное применение.
Альтернативой такому подходу является одно из перспективных направлений разработки новых биопрепаратов - непосредственная модификация пробиотических штаммов путем клонирования генов антивирусных белков. Это направление в течение ряда лет широко разрабатывается в ГНЦ ВБ «Вектор», где были созданы штаммы микроорганизмов, продуцирующие цитокины, в частности Bacillus subtilis 2335/рВМВ 105, продуцирующий альфа 2 -интерферон /Патент РФ N 1839459/. Созданный на его основе пробиотик Субалин, наряду с высокой антибактериальной активностью обладает антивирусными свойствами /Чудновская Н.В. и др., 1995; Белявская В.А. и др., 2002/. Следует отметить, что штамм В.subtilise составляющий основу препарата субалин, является
6
строгим аэробом. А как известно, внутренние полости организма значительно различаются по уровню аэрации и имеют протяженные анаэробные участки. Эту проблему можно решить путем составления микробного консорциума из штаммов, дополняющих свойства друг друга. Поэтому разработка препаратов на основе генетически модифицированных микроорганизмов, способных осуществлять доставку в организм терапевтических белков при оральном введении является весьма перспективной и актуальной задачей.
Цель и задачи исследования Целью настоящей работы явилось конструирование генетически модифицированного штамма Bacillus licheniformis, продуцирующего альфа 2 - интерферон для потенциальной его доставки в организм при оральном введении и создание консорциума из рекомбинантных штаммов Bacillus для нового пробиотического препарата. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Сконструировать генетически модифицированный штамм Bacillus licheniformis, продуцирующий ИФН-а2 и изучить возможность его использования в качестве вектора доставки целевого белка в организм.
- Сконструировать на его основе микробный консорциум, включив дополнительно ранее созданный штамм B.subtilis для разработки пробиотического препарата с улучшенными свойствами.
- Разработать технологию изготовления препарата и получить опытные партии для проведения испытаний.
- Провести испытания эффективности опытных партий препарата в птицеводстве.
Научная новизна Впервые сконструирован и подробно исследован генетически модифицированный штамм Bacillus licheniformis 2336/pBMB105, кодирующий ген интерферона. Исследован консорциум рекомбинантных штаммов Bacillus и показана перспективность его использования для разработки нового пробиотического препарата с улучшенными свойствами.
7
Разработан пробиотик субалин-форте и исследована его эффективность для повышения хозяйственно-экономических показателей при выращивании цыплят-бройлеров кросса «Сибиряк».
По результатам проведенных исследований получены патенты РФ: «Штамм бактерий Bacillus Hcheniformis, обладающий антивирусной и антибактериальной активностью» (N2172343, 1998) и «Пробиотический препарат комплексного действия» (N2159625,1999).
Практическая значимость Предложен новый пробиотик субалин-форте для повышения хозяйственно-экономических показателей птицеводства. Сконструирован генетически модифицированный штамм Bacillus licheniformis 2336/рВМВ105, продуцирующий интерферон, который может быть использован для разработки новых пробиотических препаратов. На основе материалов диссертации разработаны технические условия получения препарата субалин-форте. ф Основные положения, выносимые на защиту
- рекомбинантный штамм Bacillus licheniformis 2336/pBMB 105, способный к стабильному поддержанию плазмиды, обеспечивающей экспрессию целевого белка с антивирусными свойствами (рекомбинантного интерферона) в условиях in vitro и in vivo;
- генетическая модификация - трансформация плазмидой рВМВ 105 с клонированным геном альфа 2 -интерферона не изменяет полезных свойств реципиентного штамма: антагонистичекой активности против широкого круга патогенных микроорганизмов и безвредности для теплокровных;
- разработана технология поверхностного культивирования рекомбинантных штаммов Bacillus licheniformis и Bacillus subtilis, которая обеспечивает получение опытных партий препарата субалин-форте со стабильными характеристиками;
применение препарата субалин-форте повышает хозяйственно-экономические показатели птицеводства.
8
Апробация работы Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях: VIII международной конференции «Новые направления биотехнологии» (Москва, апрель 1998 г.); VIII международной конференции "Новые информационные технологии в медицине и экологии (Гурзуф, 2000); международной конференции «Проблемы биологической и экологической безопасности» (Оболенск, май 2000 г.); I международной конференции "Актуальные проблемы производства и переработки продуктов животноводства и птицеводства" (г.Уфа, 2000); международной научно-практической конференции «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы» (Киров, 2001); международной научно-практической конференции «Пища. Экология. Качество» (Краснообск, февраль 2001 г.); 2-м московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003 г.).
Публикация результатов исследований По теме диссертации опубликовано 3 статьи в научных журналах, 1 статья в международном сборнике, 11 работ в материалах российских и международных конференций. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 141 странице. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложений. Иллюстрирована 16 таблицами и 10 рисунками. Список литературы включает 205 источников, в том числе 128 иностранной литературы.
Искреннюю благодарность за помощь и поддержку в выполнении данной работы автор приносит д.б.н. Белявской В.А., д.б.н. Масычевой В.И., своим коллегам, принимавшим участие в работе: Ромашевой Н.Г., Алексеевой М.В., а также к.б.н. Лебедеву Л.Р. и д.б.н. Аликину Ю.С. за консультативную помощь и ценные советы при написании данной работы. Автор выражает благодарность к.в.н. Хрусталевой Н.С. за помощь и поддержку в проведении экспериментов по исследованию эффективности препарата субалин-форте в птицеводстве.
9
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Перспективы и современные подходы к разработке биопрепаратов на основе живых микроорганизмов
Несмотря на значительные успехи медицины, особенно в области антибиотиков, инфекционные заболевания желудочно-кишечного тракта и их последствия остаются главной клинической проблемой. Борьба с инфекционными заболеваниями должна базироваться не только на знаниях о патогенных микроорганизмах (возбудителях этих заболеваний), но и нормальной микрофлоре, которая имеет огромное значение в возникновении и развитии болезни, способствует или препятствует ее проявлению, а нередко блокирует пути и возможности развития инфекционного процесса. Большое число работ посвящено месту и роли нормальной микрофлоры в кишечном биоценозе /Воробьев A.A. и др., 1997; Панин А.Н. и др., 1998; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2000; Rolfe D., 2000; Митрохин С.Д., 2004/. 1.1. Взаимосвязь нормальной микрофлоры и антиинфекционной резистентности организма
На заре XX столетия знаменитый русский биолог И.И.Мечников впервые выдвинул идею о ведущей роли микроорганизмов, обитающих в организме человека и животных, в поддержании гомеостаза и в возникновении болезней. Он сформулировал основные положения о наличии связи между продолжительностью жизни, иммунитетом и аутофлорой организма-хозяина, которые остаются актуальными и в наше время /Митрохин С.Д., 2004/. Тесная связь, существующая между нормальной микрофлорой организма и функционированием всех его органов и систем, очевидна. Весь физиологический статус организма теснейшим образом связан с его нормальной микрофлорой.
Нормальная микрофлора организма - совокупность множества микробиоценозов, которые характеризуются определенным составом и занимают определенную экологическую нишу (биотоп) в макроорганизме. Наиболее сложные микробиоценозы у млекопитающих - микрофлора толстой
10
кишки, рта, носоглотки, более простые - микрофлора поверхности кожи, носовых ходов и гениталий.
Согласно современным воззрениям нормальная микрофлора человека представляет собой некий «экстракорпоративный орган», состоящий из огромного числа микроорганизмов, объединенных в единую экологическую систему. Количество микробных клеток, присутствующих на коже и слизистых оболочках макроорганизма, контактирующих с внешней средой, превышает число клеток всех его органов и тканей вместе взятых. Микробные ассоциации (микробиоценозы), занимающие ту или иную экологическую нишу в организме хозяина, характеризуются сложной иерархической структурой, различными межвидовыми отношениями и многоступенчатыми метаболическими процессами, конечным результатом которых являются биологически активные соединения - микробные метаболиты, которые вносят значительный вклад в физиологию организма ф хозяина /Бондаренко В.М., 1997; Митрохин С.Д., 2004/.
Нормальная микрофлора человека имеет большое значение не только для поддержания на оптимальном уровне метаболических процессов, протекающих в макроорганизме, но и для создания высокой колонизационной резистентности организма-хозяина по отношению к патогенным микробам /Воробьев A.A. и др., 1997/. Кроме того, нормофлора играет важную роль в обеспечении иммуностимулирующей, витаминобразующей и ферментативной функций организма, снижении содержания холестерина в крови, а также антимутагенном, антиканцерогенном действии и т.д. Однако основная функция нормальной микрофлоры - защитная, так как бактерии-симбионты человека обладают выраженной антагонистической активностью по отношению к патогенным и оппортунистическим микроорганизмам. Она направлена, прежде всего, на подавление колонизации открытых полостей макроорганизма возбудителями и ингибирование транслокации микробов во внутренние органы и ткани ^ хозяина. Эта функция нормофлоры реализуется через механизмы ее
11
конкуренции с патогенными и условно патогенными микроорганизмами за питательные субстраты и сайты адгезии, а также путем продукции антагонистически активных веществ - различных органических кислот, антибиотикоподобных веществ, лизоцима, перекиси водорода и т.п. /Бондаренко В.М., 1998; Змушко Е.И. и др., 2001; Williams JE, 2003/. Так, например, бифидобактерии образуют в процессе своей жизнедеятельности молочную, уксусную, муравьиную и янтарную кислоты, что создает кислую среду в кишечнике и препятствует колонизации его посторонними микроорганизмами, попавшими сюда извне. Лактобактерии в процессе брожения молочной кислоты образуют антибиотические вещества - лактолин, лактоцидин, ацидофилин. Тем самым представители нормальной микрофлоры кишечника тормозят рост и размножение условно патогенных и патогенных микроорганизмов - энтеропатогенных кишечных палочек, клебсиелл, протеев, некоторых видов сальмонелл и шигелл, золотистого стафилококка и др. /Панин А.Н. и др., 1998; Глушанова H.A. и др., 2004; Митрохин С.Д., 2004/.
Иммуномодулирующая функция нормофлоры связана с синтезом клетками грампозитивных бактерий мурамилдипептида, оказывающего стимулирующее действие на фагоциты (их захватывающую и переваривающую функции) и воздействием липополисахарида О-антигена грамотрицательных бактерий, который стимулирует синтез иммунокомпетентными клетками секреторных антител, различных цитокинов и интерферона/Воробьев A.A. и др., 1997/.
В любом микробиоценозе различают постоянно встречающиеся виды микроорганизмов - автохтонная или резидентная микрофлора, и случайные -аллохтонная или транзиторная. Макроорганизм со всей совокупностью микробиоценозов представляет собой единую экологическую систему, несущую в себе элементы саморегуляции, способную к поддержанию и сохранению в условиях взаимодействия с постоянно изменяющимися условиями внешней среды. Ее компенсаторные механизмы обеспечивают преобладание в микробиоценозах резидентной микрофлоры. Если
12
интенсивность внешнего воздействия (техногенные загрязнения окружающей среды, повышенный радиационный фон, химиотерапевтические препараты, пестициды и другие яды, стрессы, вирулентные микроорганизмы и т.п.) превосходит компенсаторные механизмы, происходят экологические сдвиги в микробном пейзаже кишечника, что приводит к развитию патологических процессов (локальной или генерализованной инфекции и др.) /Панин А.Н. и др., 1998; Сидоров М.А. и др., 2000/.
Микрофлора человека составляет основу его микроэкологии. Организм человека населяют примерно 500 видов бактерий, не считая персистирующих вирусов, простейших, а также грибов. Они заселяют все поверхности организма, соприкасающиеся с внешней средой: кожу, верхние дыхательные пути, желудочно-кишечный тракт на всем его протяжении, урогенитальный тракт. При этом видовой состав микрофлоры качественно и количественно сформировался в зависимости от характера микроэкологии в биотопах. Это вполне естественно, так как каждый вид микробов требует оптимальных для своей жизнедеятельности условий, обеспечивающих удовлетворение его собственных биологических потребностей, а также адаптацию к тому микроокружению, которое складывается в местах его обитания. Характер микроокружения, т.е. микроэкология в биотопах, эволюционно сложился и приобрел устойчивость применительно к видовым особенностям микроорганизма, а также физиолого-анатомическим, биохимическим и иным особенностям данного организма и вида /Воробьев A.A. и др., 1997/. Совокупность бактерий всех микробиоценозов организма млекопитающих по количеству клеток в сотни раз превышает общее число клеток всех тканей и органов макроорганизма и составляет 1014-1016. Они образуют своеобразный «экстракорпоральный» орган. Этот «орган», как и любой орган человека, имеет свои функции, критерии и показатели функционального состояния, т.е. нормы и отклонений от нормы. Огромное количество микробных клеток и их видовое разнообразие обеспечивает участие нормальной микрофлоры в самых разных физиологических функциях макроорганизма. Микрофлора
13
оказывает как положительное, так и отрицательное влияние на жизнедеятельность и состояние организма человека. К положительным функциям микрофлоры следует отнести:
1) колонизационную резистентность, основным механизмом которой является активация иммунной системы;
2) синтетическую функцию, т.е. способность бактерий синтезировать необходимые организму биологически активные соединения, такие как витамины, антибиотики, гормоны;
3) детоксикацию экзогенных и эндогенных субстратов и метаболитов;
4) обменную функцию, т.е. участие бактерий в метаболизме белков, углеводов, липидов, нуклеиновых кислот, солей, металлов, желчных кислот и других жизненно важных веществ /Воробьев A.A. и др., 1997/;
Наконец, бактерии способствуют пищеварению, оказывая морфокинетическое действие на слизистые оболочки, на абсорбцию абиотических компонентов, транзит питательных веществ, газовый состав, мышечный тонус кишечника /Шендеров Б.А., 1991/. Естественно, что все перечисленные выше функции будут стабильными, если поддерживается качественное и количественное постоянство нормофлоры в биотопах. Следовательно, изменения в микробиоценозах пищеварительного тракта, как правило, служат предвестником отклонений в физиологическом статусе организма хозяина.
К отрицательной деятельности нормофлоры следует отнести:
1) способность при определенных условиях вызывать гнойно-воспалительные и другие болезни, т.е. являться источником инфекции;
2) вызывать сенсибилизацию организма со многими клиническими проявлениями аллергического порядка;
3) формировать банк плазмид и генов в организме человека;
4) проявлять мутагенную и антимутагенную активности, которые потенциально могут иметь неблагоприятные последствия для организма.
14
Каждая из положительных или отрицательных функций нормофлоры имеет сложный механизм и еще недостаточно изучена /Воробьев A.A. и др., 1997/.
По-видимому, нормальная микрофлора представляет собой тот барьер, после преодоления которого инициируется включение неспецифических и специфических механизмов защиты. Основу нормальной полости рта, желудка, кишечника, гениталий, глубоких слоев кожи составляют не спорообразующие облигатно-анаэробные микроорганизмы. Соотношение анаэробов и аэробов в этих биоценозах составляет от 10:1 (в слюне) до 1000:1 (тонкий и толстый кишечник).
К резидентной микрофлоре желудочно-кишечного тракта относятся бифидобактерий, лактобактерии, бактероиды, энтерококки, эшерихии, дрожжеподобные грибы. При этом большую часть у человека и здоровых моногастричных животных всех возрастов, а также у жвачных животных до становления рубцового пищеварения составляют бифидобактерий. В норме их находят 108-1012 /г (до 80-90%).
Учитывая доминирующее положение бифидофлоры в кишечнике здоровых особей, а также данные клинических и микробиологических исследований, полагают, что представители рода бифидобактерий - основная таксономическкая группа микрофлоры ЖКТ, являющаяся главным показателем здоровья макроорганизма, его колонизационной резистентности /Orrhage К, Nord SE, 2000; Reuter G., 2001/. При возникновении дисбактериоза из ЖКТ первой исчезает бифидофлора, т.е. патологические изменения напрямую зависят от элиминации бифидобактерий. С исчезновением бифидобактерий снижается иммунобиологическая активность организма из-за нарушений процессов пищеварения, всасывания и всех видов обмена, понижается усвоение кальция, железа, страдает витаминосинтезирующая и ферментативная функции кишечной микрофлоры /Шендеров Б.А, 1991/. В настоящее время разработаны специальные in vitro модели, имитирующие ЖКТ и позволяющие использовать методы генной
15
инженерии для исследования полезных эффектов и роли бифидобактерий в кишечнике человека /van der Werf MJ., Venema К., 2001/.
Антагонистическая активность бифидобактерий к патогенам определяется рядом факторов: образованием субстанций с антибиотической активностью, конкурентноспособной адгезией на энтероцитах; иммуномодулирующей активностью. В процессе жизнедеятельности бифидобактерий в организме в большом количестве накапливаются аминокислоты, в том числе незаменимые (до 40% от общего количества, продуцируемого бифидобактериями). Бифидобактерий внутриклеточно аккумулируют витамины В1, В2, В6, В12, С, никотиновую, фолиевую кислоты и биотин, продуцируют в культуральную среду В6, В12 и фолиевую кислоту.
Второй по численности и значимости группой эубиотической флоры ЖКТ животных являются молочнокислые бактерии, представители рода Lactobacillus. При дисбактериозах количество лактобактерий значительно уменьшается или их не обнаруживают вовсе. Молочнокислые бактерии ферментируют углеводы и спирты, некоторые гидролизуют крахмал, синтезируют белок. Антагонистическая активность молочнокислых бактерий в отношении гнилостной, патогенной и условно патогенной микрофлоры обусловлена их способностью синтезировать многочисленные антибиотические вещества (лактоцины, лактобиотики, ряд неидентифицированных пока соединений с антибактериальным действием), перекись водорода, лизоцим, индуцировать в организме интерферон, интерлейкин, а также адгезивными и иммуномодулирующими свойствами /Шендеров Б.А, 1991; Сорокулова И.Б., 1996; BevilacquaL. et al., 2003/.
Помимо перечисленных свойств, обеспечивающих
иммуностимулирующий эффект и колонизационную резистентность, лактобактерий активно участвуют в метаболизме углеводов, белков, липидов, нуклеиновых кислот, а также в водно-солевом обмене, поддержании pH и регуляции анаэробиоза, рециркуляции желчных кислот. Лактобациллы
16
синтезируют витамины и провитамины, вырабатывают обширный спектр ферментов и коферментов, которые в совокупности с основными продуктами метаболизма оказывают биологически активное действие на организм хозяина и способствуют повышению естественной резистентности.
Один из важных механизмов предотвращения колонизации кишечника патогенами - конкуренция за места адгезии на поверхности кишечного эпителия. Микроорганизмы, обладающие адгезивными свойствами, характеризуются наличием хемотаксиса в отношении слизистой оболочки кишечника, что в значительной степени ускоряет образование ассоциативной связи с эпителиальными клетками организма хозяина. С учетом этого, различают: мукозную микрофлору (М-флору), которую составляют микроорганизмы, ассоциированные со слизистой оболочкой, и полостную (П-микрофлору), локализующуюся в просвете кишечника. Состав П- и М-микрофлоры пищеварительного тракта может существенно различаться по количественной и качественной характеристикам и изменяться в зависимости от пищевого рациона и внешних воздействий. В проксимальном отделе ЖКТ М-микрофлора представлена преимущественно грамположительными микроорганизмами, а в дистальном отделе - грамотрицательными и грамположительными. Весьма важно, что М-микрофлора повышает колонизационную резистентность кишечника, оказывая защитный эффект чисто механически - препятствуя пенетрации слизистой оболочки патогенными и условно патогенными микробами и конкурируя с ними за взаимодействие с рецепторами эпителиальных клеток слизистой кишечника. Доказано также, что М-микрофлора способствует нормальному течению метаболических процессов в эукариотических клетках, а эпителиальные клетки используют большинство продуктов конструктивного метаболизма бактерий. С этих позиций в микроэкологии пищеварительного тракта чрезвычайно важны сроки заселения его отдельными микроорганизмами. В частности, если сразу после рождения в указанную полость первыми проникают условно патогенные и патогенные бактерии с высокой
17
адгезивностью, то в течение нескольких часов они занимают все свободные экологические ниши и образуют М-микрофлору. При этом облигатные виды нормальной микрофлоры даже при обильном поступлении в пищеварительный тракт составляют лишь П-микрофлору. Тогда макроорганизмы в 100% случаев заболевают /Тараканов Б.В., 2000/.
Таким образом ясно, что здоровье человека в значительной мере зависит от благополучного состояния его кишечника. Истории многих заболеваний изначально связаны с нарушениями процессов обмена веществ, обусловленных сдвигами в микрофлоре человека.
Изменения состава и количественного соотношения в микробиоценозах кишечника, определяемые термином «дисбактериоз», возникают от разнообразных причин: характера питания, возраста, проведения антибактериальной, гормональной, лучевой терапии и/или химиотерапии, наличия хронических заболеваний пищеварительного тракта и других. В основе их развития лежит изменение условий обитания в биотопе, в результате чего популяции одного или нескольких видов, составляющих микробиоценоз, или видов, занесенных из других биотопов хозяина или внешней среды, получают преимущества для роста и размножения перед своими конкурентами и приобретают несвойственное им доминирующее положение в микробиоценозе. Спектр клинических синдромов и патологических состояний, первые этапы патогенеза которых могут быть связаны с дисбактериозом, в первую очередь толстой кишки, в настоящее время достаточно широк и имеет тенденцию к увеличению.
Примером могут служить: диарея, запор, колит, нарушение всасываемости, гастрит, дуоденит, язвенная болезнь, коагулопатия, ишемия, гипо- и гиперхолестеринемия, ревматоидный артрит, спондилоартрит и другие поражения соединительной ткани, некоторые злокачественные образования, кариес, мочекаменная болезнь, дерматит, аллергия, поражения печени, суперинфекция, сепсис и др. /Шендеров Б.А., 1991; Митрохин С.Д., 2004/.

Благодарю за развернутую и исчерп. инф.
Я и сам терпеть не могу ГМИ.
Но на этот раз у них кажется получилось что надо)
То есть как человек с биохим. обр(в тч 2 года микры) я пока не вижу препятствий к тому, чтобы лечиться штаммом B. subilis ВКПМ В-7092 (IC-16).
Есть еще хороший препарат "Гриппферон" - но там альфа-2-инт. просто был в буфере.
Помогает здорово.

Ветом 1,1 - а мы кого лечить собираемся? Препарат ВЕТЕРИНАРНЫЙ! Если КРС, то да, хоть залечитесь, а себя,,,
"Странный у нас народ, понавыдумывает себе болячек, а потом лечится" (из разговора коллег)

Русич
я пока не вижу препятствий к тому, чтобы лечиться штаммом B. subilis ВКПМ В-7092 (IC-16).

если вы не видите, лечитесь

долго не мог вспомнить откуда название препарата знакомо.
Наконец-то вспмнил - коту ветеринар назначал. 😊